2015年4月30日,纽约 ——科学服务领域的世界领导者赛默飞世尔科技(以下简称:赛默飞)的研究人员和密歇根州大联合开发了一项基于综合二代测序技术的癌症研究Panel,并采用赛默飞的Ion PGM对其进行了验证。

Oncomine Comprehensive Panel可同时评估DNARNA突变,目前正在进行美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)的Match实验——这是一项试图根据病人基因组谱系将其分入不同的临床实验组的一揽子实验。

据《Neoplasia》期刊报道,研究人员宣称此Panel是一种“快速、可高度规模化的研究方法”,且“其结果与常规的分子诊断检测样品及分子学标准品高度一致”。

为设计该Panel,研究团队充分利用Oncomine数据库内容来确定相关的基因改变。涉及的数据库包含来自于700,000种细胞系、异种移植物和癌症临床样品的突变、拷贝数变异及基因融合数据。

团队首先为最终的设计开发了多个DNARNA Panel。此类Panel共涵盖143种癌症相关基因,其中包括73种致癌基因,49种拷贝数变化基因,26种肿瘤抑制基因以及22种基因融合驱动基因。靶向DNA Panel包含2530种扩增子,涵盖130种基因的260,717个碱基对。靶向RNA-seq Panel包含154个引物对,靶向148种已知的基因融合亚型,同时可进行RETROS1ALK5' 端和3'端表达检测,从而可使客户发现新的基因融合。

此外,作者还表示,Panel的“关键构成”是与某个潜在治疗选项知识库相关联的分析方法。

作者还提到,DNARNA构成可结合在一起进行模板制备并采用318芯片在PGM上进行为时4小时的测序。作者表示,这一检测方法的另一优势是起始样品量低——仅需20 ngDNA15 ng的RNA。

为验证Panel的性能,团队采用包含398种变异(预期等位基因变异频率0.2)的预设计细胞系,通过Panel评估了其DNA构成。Panel检测出了364/365(即99.7%)的SNV,以及25/33(即75.8%)的插入/缺失。在未检测到的8种插入/缺失之中,有3份的碱基长度超过10,5份为单次聚合反应之中发生的单核苷酸插入和缺失。“在聚合反应之中,如何精确地鉴定插入和缺失已成为目前Ion Torrent测序技术明确的挑战”。

之后,他们对包含不同的变异频率的突变的细胞系混合物的DNA进行了检测。总得来说,相关细胞系含有16种可被Oncomine Panel靶向的已知突变。在采用一种自动变异识别工具处理后,他们可以检测出15/16的变异。其中未检出的一种变异为聚合反应开始时的次级移码缺失(突变频率为7.5%)。

研究团队随后采用来自于三组世代研究的福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品验证Panel105份常规的分子学诊断送检样品,104份肺癌相关样品,118份前列腺癌样品。大约三分之一的样品至少保存三年,6份样品由于文库质量太低无法分析。

从所有三组世代研究的平均结果来看,DNA panel获得了5,142,690份绘图读段, 97%中靶;整个靶向碱基实现了1,941x的覆盖度;93.6%的靶向碱基为至少20个读段所覆盖;每份信息样品检出了202种变异。而在使用RNA panel时,研究团队获得了306,872绘图读段,包括210,712个对应于五种看家基因的读段。

最后,研究团队通过一组临床世代研究对Panel进行了验证,针对105份临床分子检测诊断送检FFPE样品,对EGFR、BRAF、KRASALK基因改变展开评估。这些样品包含29份结直肠腺癌、23份肺腺癌、48份黑色素瘤样品,以及其他四份其他癌症样品。每份样品,他们分别平均鉴定出了1.7、0.81.7份相关的SNV、插入和缺失、CAN。最常见的突变基因为TP53、BRAFAPC,在送检样品之中的突变几率分别为33%、31%24%。他们还鉴定出了四种基因融合,其中包括ERC1:BRAF融合的多种亚型。

总计来说,PanelDNA构成具有100%的灵敏度和特异性,可直接靶向临床鉴定出的EGFR、BRAFKRAS突变。PanelRNA构成则与T2:ERG融合具有100%的一致性,鉴定出了5/7(即71%)的已知ALK融合。他们还检测到一种未检出的融合,但检测结果低于自动检出的阈值。此外,Panel还鉴定出了另外两种相关融合。

随着临床测序越来越普遍,作者表示,“OCP的主要优势就在于可能整合到多个独立的机构之中(而非供单一的集中检测中心使用),可接受来自于分子生物学家、病理学家和肿瘤学家的直接的有益干预。”此外,整套检测方法还“在今后的肿瘤学精密医学研究方法有着潜在应用价值,如在NCI Match实验之中,可由多个检测机构对3000种癌症样品进行测序。