实现精准的细胞计数的四个关键要素

许多生物科学应用需要精准地测量细胞数量和存活率,然后再进行下游分析。您可以采用传统的血球计数仪和显微镜进行手动评估或者采用自动细胞计数仪自动计数,如Invitrogen™ Countess™ II FL Cell Counter.

当使用玻璃制血球计数器及显微镜进行手动细胞计数时,经验丰富的细胞生物学家对单一样本进行多次计数的差异通常为10%或更高。当多位科学家对单一样本进行计数时,差异值通常超过20%。使用自动细胞计数仪可以最大程度地消除手动计数的主观性,以及总细胞计数和存活率检测中的用户间差异,帮助您节省时间。Countess II自动细胞计数仪的用户遵循本文列出的小技巧,计数间差异一般应可以达到<5% 的CV值。

不论选择何种细胞计数平台,对单一样本进行重复计数或计数多个样本时获得精准的计数值至关重要,但有时也面临诸多挑战。本文列出了实现精准的细胞计数的四个关键要素,并按照重要性排序,只要记住这四点,即可最大程度地降低差异,使细胞计数结果的可信度最大化。


样品制备

如何制备目的细胞对手动和自动细胞计数的影响极大。应保持样本均匀性,方能确定计数差异是由实验处理还是样本制备条件引起的。

下面是样本制备的一些小技巧,可以提高您的计数准确度和精度。

  • 标准化细胞操作步骤。在很多情况下,应比较来源于不同的培养瓶或培养板中的多个样本的细胞存活率和浓度。必须认识到细胞操作步骤的微小差异(包括水解、移液或离心步骤) 会对不同样本的总细胞计数和存活率产生极大的影响。
  • 确保细胞悬液混合均匀。利用短暂且温和的涡旋振荡方法或手动搅拌试管——有时被称为“手指轻弹”技巧——可以制备均匀的悬液。将细胞置于实验台上静置会然后移液,会导致细胞沉至管底,形成人为的浓度梯度,存在出错的可能性。细胞样本静置时间越长,浓度梯度越大,从而提高了差异性。为使移液差异最小化,应按照上述方法混合样本,然后从试管中间而不是试管底部(底部可能形成人为的高浓度细胞)移液。
  • 尽可能减少碎片。不论选择何种计数或染色方法,含有大量碎片的样本都难以进行计数和存活率评估。碎片的数量因细胞类型、培养条件、制备方案和使用的试剂不同而异。考虑碎片可能的形成原因并采用措施尽可能地减少碎片,可以提升细胞计数和存活率结果的准确性。

    最大程度地减少细胞样本碎片的常见技巧:
    • 在使用前离心台盼蓝
    • 使用新鲜配制的染色试剂(台盼蓝、NucBlue™ Live、碘化丙啶等)
    • 使用经过过滤除菌的培养基和缓冲液
    • 根据需要的时间间隔传代细胞

正确设置焦距

正确聚焦是获取准确的存活率信息的关键。不同细胞计数的焦距一致性是样本间差异最小化的关键。手动计数细胞时,设置焦距是十分主观的,因用户而异。但许多最新的自动成像细胞计数仪采用自动聚焦特性,不仅方便快捷,而且消除了调整焦距的主观性。这可以提高样本间的计数一致性。

图1所示的图像反映了相同样本的同一视野(FOV),并显示了焦距设置不正确时采用手动和自动计数方法观察到的差异。图1A为正确聚焦的图像,图1B中的焦点不正确。聚焦不当的图像会错误地将活细胞识别为死细胞。请记住,不论您采用何种计数方法,只有在视野中可见的细胞方能被计数。

Countess screen shots showing correct focusing settings

图1. (A) 焦距设置正确时,活细胞(绿色圆圈) 中心亮,边缘稍暗。(B) 死细胞(红色圆圈) 有些许离焦,如果采用台盼蓝染色,则呈均匀的暗色。


染色和光强度

明场计数

0.4%台盼蓝溶液常用于快速评估细胞存活率。拒染法的理论基础是活细胞不摄取细胞非渗透性 的染料(如台盼蓝),但死细胞可透过并吸收染料,结果如图1A所示。采用手动计数方法,用户不仅需要手动调整焦距,还需要调整不同样本的明场光强度,而自动细胞计数仪(如Countess II FL) 则能够自动调整光线和焦距,获得最佳图像质量,用于测定存活率。如果光强度过高,则屏幕会呈现褪色效果(图2A)。如果光强度过低,则背景过暗(图2B)。光强度设置过高或过低都会导致细胞计数不正确。

荧光检测

使用能够检测荧光的自动细胞计数仪时,应考虑两个主要变量——信噪比和背景。在任何一项荧光染色研究中,都必须使背景(如噪声) 最小化同时使信号最大化,这样可以提高灵敏度并最大程度地提高信噪比。实现上述目标的要求之一是通过调整光源正确设置激发强度。图3是激发强度极佳和激发强度过高的图像比较。

Countess screen shots showing correct brightfield light intensity settings

图2. (A) 明场光强度设置过高。(B) 光强度过低。

Countess screen shots showing correct fluorescence light intensity settings

图3. (A) 采用最佳荧光强度可以获得出色的图像。(B) 光强度过高的图像。


设门

最后,相比手动计数,使用自动细胞计数仪能够轻松包括或排除(设门) 计数细胞,但如果在不同的样本间使用不同的设门策略,则会引起计数不稳定。一般而言,比较样本时应采用类似的设门策略。如果使用Countess II或II FL,通过结果界面上的“更多”(More)按钮调整设门参数,并将设门保存为“模式”(Profile) (图4),以方便需要时调用。

设门参数通常单独或组合使用,包括:细胞大小、亮度、圆度和荧光强度。总之,这些参数使用户能够精确调整特定的细胞计数应用中哪些细胞被包括或排除。

圆度

碎片的数量因细胞类型、培养条件、制备方案和使用试剂的不同而差异巨大。一些典型的碎片 包括污染的台酚蓝颗粒以及较老的培养物或全血制备物中的死细胞或染色细胞的细胞碎片。在大多数情况下,碎片的形状不规则,采用台酚蓝染色呈暗色,在许多自动细胞计数仪(包括ountess II自动细胞计数仪) 中使用圆度参数可以将其高效“排除”。

在图5A和5B中,不采用和采用设门,分别在明场模式下计数含有大量碎片的样本。一些碎片被检测为死细胞;碎片体积较小,形状不规则,且相比背景信号较弱,需要通过“更多”(More) 按钮采取设门策略。实时更新结果界面上的图像,用于直观检测的客户反馈。

大小

根据大小进行明场设门通常应用于有多种细胞类型的应用(如神经和干细胞培养、血液样本或有 碎片存在时)。使用自动细胞计数仪,用户可以轻松设门,在计数中包括或排除特定的细胞(图6)。采用Countess II自动细胞计数仪,必须注意,用户可以针对活细胞和死细胞群体单独设门,从而提高了灵活性。此外,这些设门可以保存供以后使用。

亮度

根据荧光强度设门提高了设门策略的灵活性。在许多情况下,用户只想知道多少细胞的信号 模糊以及明亮,或者表达荧光蛋白。图7A显示了表达GFP的样本,包含两种细胞群体——信号模糊以及明亮;信号模糊的细胞被排除,13%的计数细胞表达较强的GFP。在图7B中,存在两种荧光颜色,可通过结果界面的“更多”(More) 按钮,根据大小、亮度、圆度和荧光强度单独设门。Countess IIFL可以保存上述参数,以确保样本间的一致性,供以后使用。


图4. 可以调整各个阈值参数,然后根据需要进行保存,创建必需的模式。

Countess screen shots showing effect of gating

图5. (A) 未设门;请注意红色圆圈表示的信号微弱的碎片。(B) 应用大小、亮度和圆度设门;请注意没有圆圈圈出的碎片。


图6. 浅灰色的条块表示小于10 _m的细胞被排除出细胞计数结果。

Countess screen shots showing results

图7. (A) 50 RFU左右的浅绿色条块被排除出GFP阳性计数细胞。(B) 包含两种荧光颜色,可分别根据大小、亮度、圆度和荧光强度设门。

总结

造成细胞计数结果差异的原因有很多种。样本制备、焦距设置、光强度设置和设门策略都会对结果产生影响。使用自动聚焦、自动明场光学调整且具有多项设门的自动细胞计数仪可以提升细胞计数和存活率报告的可靠性。保存模式以实现不同样本设置的一致性可以帮助提升结果的准确性。