疑难问题

活细胞在延时成像过程中受损而变得不健康

细胞在低波长和高波长的激发光照射(为了激活荧光基团)下均可能受到损伤。研究中所使用的大多数细胞都不能适应典型成像实验中直接穿过它们机体的大量光子。

在成像过程中,如果观察到细胞从培养器皿上脱离、细胞膜起泡或出现大的液泡,或者发现线粒体肿大、荧光蛋白聚集等现象,便可以推断细胞存在应激反应并因此变得不健康。

Stained cell image showing two cells: one unhealthy cell showing blebbing next to a healthy cell.   图1. 图中上方的细胞表现出严重的细胞膜起泡和荧光蛋白聚集,而其下方相邻的另一细胞则保持着较为健康的状态。


此外,光激活的荧光基团会释放活性氧,而这些活性氧可能会破坏邻近的细胞结构。

Cell image montage showing how extended illumination renders a sample GFP-expressing cells unable to fluoresce and a sample of cells unable to proliferate.

图2. 上图:转染了CellLight® H2B-GFP的活HeLa细胞的明场和绿色荧光通道的叠加图。在捕获这张图像之前照射区域中的细胞已经历了长达10小时的持续照射;在非照射区域中的细胞则仅在本次采集图像时才受到照射。在持续照射区域的样本上,我们可以观察到GFP信号的削弱和丢失(绿色通道的图像),同时也能观察到明显的细胞损伤,包括细胞皱缩、变圆和线粒体肿大(明场图像);下图:针对CellTracker® Deep Red试剂染色的HDFn细胞培养物开展的划伤实验。光照射区域的样本经历了10小时的持续照射,本区域中的细胞表现出存活力的丧失,因而无法生长进入划伤区域,而非照射区域中的细胞则仍然具有生长进入划伤区域的活力。


两种过程都可被称为光毒性,而且有时并不会作明确区分。消除光毒性的主要办法是优化显微镜设置并在实验中使用尽量低强度的光照射。

如何避免光毒性


优化荧光显微镜光路

一种方法是将成像系统设计得非常灵敏,使之能够尽量捕获大多数的发射光,这样一来,便可以使用更低强度的照射来激发荧光基团,从而使细胞损伤减少到最小。通常做法是将荧光显微镜的光路设置优化到最高效的程度,具体手段包括使用最灵敏的检测器(通常采用CCD摄像机)、使用尽可能少的激发光和针对所使用的荧光基团选取最佳激发波长。


尝试使用更低的光照射强度和更短的曝光时间

某些时候您只能利用现有的仪器并尝试做到最好。这需要使用最佳信噪比的光照,同时又保持最低水平的荧光基团激发,即意味着需要在系统不变的前提下尽可能优化实验方案,以实现最低的光照射强度和最短的曝光时间。在某些情况下,特别是希望进行长时程的成像时,通过牺牲分辨率来换取更健康的细胞也是一种适当的做法。具体操作方法包括缩短曝光时间、采用像素组合技术或使用更低的放大倍数。当然也可以尝试使用红移的荧光基团来帮助保护细胞的健康,具体参见活细胞成像部分

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