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The GeneArt® Chlamydomonas Protein Expression Kit is a second-generation Chlamydomonas cloning and expression system. Like the first-generation GeneArt® Chlamydomonas Engineering Kit, this new system offers transgene expression from the nuclear genome of eukaryotic green alga Chlamydomonas reinhardtii 137c, but is optimized for high-level expression, provides selection against gene silencing, and offers dual protein tags for detection and/or purification of your gene of interest.

The kit includes frozen Chlamydomonas reinhardtii 137c cells, MAX Efficiency® Transformation Reagent for Algae, expression vector, OneShot® TOP10 Competent E. coli cells, and easy-to-follow protocols. Our Gibco® TAP Growth Media, offered separately, is optimized for the growth and maintenance of Chlamydomonas.

  • Express up to 1% total soluble protein of your gene of interest
  • Select against gene silencing, even over multiple passages
  • Detect and purify your gene of interest with 6His TEV and/or V5-His epitope tags
  • Use (optional) seamless assembly to create your constructs
  • Enables reliable results with exceptional strain viability and purity

更好的表达效果,减少了基因沉默,同时可选纯化标签

通过pChlamy_4 载体在衣藻细胞核基因组中进行转基因表达相比叶绿体表达有着多个优点,例如翻译后修饰状况及蛋白靶定及/或分泌等。

  • 将内源的基本启动子RbcS2与激活子(Hsp70A)结合在一起,可提高你感兴趣基因的表达水平
  • 将感兴趣基因与博来霉素/ zeocin抗性基因sh-ble进行融合,从而可避免沉默现象
  • 通过使用口蹄疫病毒(FMDV)所含的2A多肽自剪切序列来介导抗性标签与感兴趣蛋白间的剪切,从而得到两种单独的蛋白质
  • 3’ UTR 序列可作为正确的转录终止信号,也可带来额外的益处,包括可增强翻译效率、mRNA稳定性及多聚腺苷酸化信号等
  • 双重蛋白标记6His TEV及V5-His表位可与感兴趣基因的某端或两端融合,你也可以选择完全不进行标记
  • 使用 无缝组装 技术(可选)来创建你自己的构建载体/li>

 

Trichoderma reesei的一种水解酶的基因,木聚糖酶(xyn1)克隆至载体pChlamy_4中并转化至Chlamydomonas reinhardtii 137c。使用 EnzChek® Ultra Xylanase检测试剂盒(货号E33650)来测量木聚糖酶活性。pChlamy_4构建('Prot Exp')的木聚糖酶活性水平要比使用我们第一代GeneArt®藻类基因工程试剂盒系统('Genetic Eng')所观察到的高17倍。

Trichoderma reesei的一种水解酶的基因,木聚糖酶(xyn1)克隆至载体pChlamy_4中并转化至Chlamydomonas reinhardtii 137c。使用免疫印迹分析来检测木聚糖酶表达水平,结果表明木聚糖酶蛋白在总可溶蛋白中占了大约1%。

无基因沉默效果的筛选

为了避免 Chlamydomonas reinhardtii中常出现的转基因沉默现象,我们全新的pChlamy_4载体经过了专门设计,蛋白会与博来霉素/ zeocin抗性基因sh-ble (Rasala et al., 2012)作为融合转录本进行表达。而在抗生素抗性基因与感兴趣基因之间则插入了来自口蹄疫病毒(FMDV)的2A多肽自剪切序列。这段序列会编码大约20个氨基酸的短序列并介导正确的剪切作用,从而得到两个独立的蛋白质。相比其他系统,使用该系统我们可观察到阳性转化株可维持更长时间的高表达水平,即使在存在或不存在筛选压力情况下经数次传代仍可保存(参见下图)。

Trichoderma reesei的一种水解酶的基因,木聚糖酶(xyn1) 克隆至载体pChlamy_4中并转化至Chlamydomonas reinhardtii 137c。在2周时间内使用EnzChek® Ultra Xylanase 检测试剂盒(货号E33650)每天对木聚糖酶活性进行检测,并与其他系统表达该基因的水平进行对比。木聚糖基因与pChlamy_4载体上的博来霉素/ zeocin抗性基因sh-ble进行融合后可避免沉默现象,所以蛋白在经过若干代传代后仍可表达,无论是否施加了筛选压力。

增强衣藻的转染效率

衣藻的研究与开发中最大的障碍之一是向衣藻藻株中引入外源DNA。可以考虑使用玻璃珠搅拌、电穿孔、微粒轰击等方法,不过转化效率常常很低。在电穿孔前使用MAX Efficiency®藻类转化试剂对细胞进行预处理,可增强衣藻藻种的多种藻株的转化效率。它可以提高衣藻细胞壁的渗透性,并促进电穿孔过程中DNA导入至细胞核中。如今,我们可在10种不同的衣藻藻株中观察到相比过去推荐的转化条件来说提升>200倍的转化效率,包括野生型和突变型,使用环状或线性DNA均可,也可使用PCR产物片段。

Gibco® TAP 生长培养基—专门针对衣藻而优化

Gibco® TAP生长培养基可单独购买或在某些GeneArt®试剂盒中已包括在内。它针对衣藻的生长和维持进行了优化。其1X的配方可让你免去费力的培养基制备步骤。其成功的瓶装设计使得在生物安全柜内的操作更加容易,从而最小化污染风险,并帮助你保持细胞培养的一致性。其优秀的包装和质量、更可靠的性能、衣藻培养中进一步增强的一致性,均有助于你获得更出色的总体实验效率和更有说服力的数据。

多功能且经过验证的藻类模型生物

Chlamydomonas reinhardtii是一种淡水绿色微藻,是生理学、分子生物学、生物化学、遗传学研究中的常用模式生物,最近也常常作为治疗用蛋白及疫苗的生产平台而倍受瞩目。它可作为遗传学平台和模式生物来帮助我们理解从光合作用和养分调控基因表达机制到鞭毛组装和行使功能的一系列过程。由于绿藻的快速生长速度及可将阳光和CO2转化为能量的能力,它也常用作生物燃料和生物制品生产的平台。由于C. reinhardtii通过植物分裂的方式进行繁殖,从最初的转化到产品制备间的时间相比植物来说要明显缩短很多,在摇瓶规模下仅需少至6周即可对生产效果进行评估,并可在4到6周内将培养规模扩大至64,000升。