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我们总结了一系列要点提示和技巧并建立了一个详细的知识库,以满足您的各类科研需要求,助您优化试验,获得最理想的结果。

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概述

GibcoGeltrex基质与胶原(大鼠尾与牛)可作为包被溶液或3D凝胶基质来使用。CELLstart底物作为一种不含异外源性物质的包被基质,专为ESC的相关应用而研发(作为动物源性的GibcoGeltrex基质或动物源性的Matrigel基质的一种替代品底物)。AlgiMatrix基质是为一种3D支架类的基质,它不支持并不为细胞提供粘附的基础,但而是为细胞球生长提供一个良好的生长环境,后续应用中也可方便易于细胞球的收取操作用于后续应用。

Gibco™ Geltrex™ 基质

GibcoGeltrex基质是减生长因子(reduced growth factor,RGF)基底膜抽提物(BME)的可溶性配方产品,是从鼠类Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤中纯化获得的。在历史上这些制备产物中含有并不会影响产品效价的乳酸脱氢酶增高病毒(LDEV),但在某些如异种移植及其他临床性研究一类的应用中可能会引发顾虑。当前我们已通过全新的生产方法去除了这种些病毒。这种些不含LDEV的试材材料经我们使用PCR方法测试确定已不含LDEV——我们使用PCR方法确认了这些产品中不含病毒。

GibcoGeltrex基质是含有细胞粘附所需的胶原IV,层粘连蛋白及其他基质蛋白和生长因子的基底膜抽提物。AlgiMatrix基质只含不具有促细胞粘附促进功能的藻酸盐。藻酸盐海绵体中没有能与细胞相互作用的成份。

是的,尝试使用不同稀释浓度的基质来包被平板。一些客户使用1:100的稀释浓度获得了更好的结果。最佳稀释浓度取决于所使用的细胞系。

如果您希望从基质上解离出中取出细胞进行培养,我们推荐您首先冲润洗细胞,之后使用胰酶/EDTA,TrypLE试剂,或使用低葡糖DMEM配制的3000U/mL胶原酶和1000U透明质酸酶溶液解离细胞。如果您希望对从基质上解离出中取出的细胞进行细胞膜表面标志物的染色,我们推荐您以机械方法解离取出细胞,如剧烈冲润洗或仔细刮下。

请注意,如果细胞培养于2D基质的条件下,则解离取出后细胞表型可能发生改变。

乳酸脱氢酶增高病毒(LDEV)会感染小鼠巨噬细胞,并导致实验室小鼠群体的持续性感染。LDEV是一类RNA病毒,会改变小鼠的体内生理机能活动,是源自可移植性肿瘤细胞系的生物材料试材的常见污染物。

是的,这是正常情况。我们在产品开发过程中也见到了类似情形。请在预包被处理后吸去GibcoGeltrex基质溶液,再按常规操作加入细胞。我们使用即用型成品Geltrex基质预先包被的平板来培养H9人体胚胎干细胞,在进执行预包被步骤时有过类似发现。

即用型成品GibcoGeltrex基质仅适用于为细胞粘附提供包被,主要为ESC和iPSC的应用进行研发。由于蛋白浓度不够高,它不适于厚凝胶或3D培养的相关应用。

AlgiMatrix™ 3D Culture System

AlgiMatrix基质在不开封的条件下可稳定放置12个月。一旦开封启,整板都需及时用掉。

我们展示了以下数据:

  1. 仔细观察培养状态的细胞,显示我们发现了细胞接种穿渗透的证据。
  2. 石蜡包埋和切片结果显示细胞穿透了在整个海绵体中接种。

轻柔温和地以一定角度加入培养基。换液时请小心操作,不要搅动基质。

一旦接种完成,细胞球形成需要大约将在5至7天内形成。接种过程中会观察到气泡。随着细胞对氧气的逐步消耗,这些气泡将在数天内消失。

InvitrogenalamarBlue试剂检测是一项用于监控细胞健康和细胞功能情况的有用的生物分析法。

可以,您可使用钙结合液,Versene(乙二胺四乙酸)或柠檬酸钠来溶解基质。剩余的细胞球可通过TrypLE试剂解离下来,计数,并在其他培养器皿瓶,或新的型AlgiMatrix基质海绵体中进行扩增。随试剂盒对应附赠的说明手册中对这些操作步骤进行了图解说明。

我们内部未对此应用进行测试,通常情况下人们认为相信如果藻酸盐支架能够在无饲滋养层细胞的条件下支持人体ES细胞的增殖,则应该也能支持小鼠ES细胞的增殖。小鼠与人体ES细胞均会形成拟类胚体,从增殖和分化的角度而言,使用在带有较大孔隙的藻酸盐支架中接种被发现对于培养这些结构非常有帮助。

使用藻酸盐实际上不会造成任何背景着色。相同的表面性质也避免了细胞的粘附效应——荧光素标记抗体等分子也很难粘附着,因此实际上未发现任何背景染色效果。

这一支架结构对于形成3D细胞球非常有帮助,因为它能够最大化地允许辅助细胞间的相互作用。用户可基于所用细胞类型来扩增建立的细胞系扩增产物,细胞球的尺寸可增至100个细胞左右。已建立的细胞系通过增加细胞球的大小(细胞球的大小可增至100个细胞左右,取决于细胞类型)进行扩增。在以三维形式条件下培养超过1-2周,的原代细胞和已所建立的细胞系在1-2周的培养后均会发生分化。

对于脐带干细胞而言,您可能希望尝试相对较高的接种密度——每个海绵体10万-30万个细胞,每天或每两天——当培养基变“黄”时——进行换液。

标准的免疫荧光检测测试适能用于3D结构。您可对AlgiMatrix基质中完整自然生长的细胞球进行直接染色,或使用Versene或/55 mM 柠檬酸三钠二水合物溶液来溶解AlgiMatrix基质,再单独对细胞球进行染色。您也可使用TrypLE试剂将细胞球进一步解离为单个细胞,再将作为分散解离的细胞进行染色。

侵润研究是对细胞穿透基质能力进行检测的研究,这一检测其模拟了细胞在体内迁转移的活性。AlgiMatrix基质未经修饰的结构中仅含有藻酸盐(源自褐海藻海带),而不含任何体内类似分子物质,所以AlgiMatrix基质与细胞侵润研究之间的相关性不是很强。 可能不是很相关。

我们的供应商在制药级藻酸盐和透明质酸的生产上领域积累了多年经验。尽管这些原料为是天然产物,但通过对我们在其他标准工艺的详细规定上外,(以藻酸盐为例)还通过确定收货包括指定收获地点,水体温度,所收获海藻海带的部位,使用严格的纯化SOP和严格精密的QC标准,来可获得最终非常标准化的产品。

最近推出的高纯度藻酸盐产品更高纯度形式不会引起之前低纯度产品所面临的敏感性反应。藻酸盐已被使用了一些年,多年来一直在体内移植(糖尿病相关研究)中领域用于包裹,例如胰腺B细胞一类的物质,而不会引起排异反应。

藻酸盐,是AlgiMatrix基质由其制成的主要成份物质,具有非常亲水的表面,含脂质的细胞脂质膜和乃至分子都不会粘附其上。正常细胞在AlgiMatrix基质中会聚集形成细胞球并产生分化结构成结构,但扩增会受到限制,因为大多数正常细胞数目的增加需要以粘附为前提。癌细胞能够在不粘附的情况下保持扩增殖,在AlgiMatrix基质中也是如此(一个例外是胚胎干细胞,这一类型的该细胞在AlgiMatrix基质中会增殖为类以拟胚体进行扩增)。不过,软琼脂与AlgiMatrix基质之间的一个主要区别在于:软琼脂是一种水凝胶,而AlgiMatrix基质则是拥有较大孔径尺寸的海绵体——细胞在AlgiMatrix基质中能够比在水凝胶(软琼脂)包裹下更容易和更迅速地进行生长。从正常细胞中区分癌细胞的传统经典方法是观察细胞的扩增殖;癌细胞(如HepG2肝癌细胞)会形成不断扩增的细胞球,而正常细胞所形成细胞球的大小尺寸和数量都不会增加。

海绵体在干燥时的高度为3-4mm左右。当海绵体重新水化时,其实体积不变——不会发生膨胀或体积增加的情况,实际上还会由于恢复了水凝胶状态而体积轻微缩小,这一情况在对接种的海绵体进行短暂离心时的情况下尤其明显(按建议试图让细胞更多地进入海绵体内部,并让海绵体均匀地分布于培养孔底部)。

某些原代细胞(干细胞除外)需要贴壁才能增殖。由于细胞不会粘附于AlgiMatrix基质,因此尽管这些细胞能够继续培养,但不会增殖而更倾向于分化。我们推荐您以高细胞密度接种植原代细胞。

使用AlgiMatrix基质的3D细胞培养体系为细胞的生长和行为提供了一个更接近生理的条件,但由于该系统更为复杂,通常也的确会带来更高的结果变异度。您可能需要在实验中设置更多的重复组和对照组。

固化缓冲液通过向海绵体系中加入钙成份来发挥作用——加入后使海绵体会变硬。解离缓冲液通过去除海绵体系中的钙成份来发挥作用——加入后使海绵体会变软。

除了InvitrogenalamarBlue细胞活性检测活力试剂(Cell Viability Reagent)之外,AlgiMatrix基质还能够与InvitrogenPrestoBlue细胞活性检测力试剂,Promega Cell Titer-Glo试剂或InvitrogenCyQuant Direct细胞增殖分化检测测定(Cell Proliferation Assay)试剂盒相兼容。具体实验方案与2D细胞培养系统几乎相同,但需要加入用纯空白AlgiMatrix基质作为空白对照组。

I型胶原

其关键应用列举如下:

  • I型胶原能够在体外诱导出微血管内皮细胞采用的纺锤状外形形态,并排列为类似实线的聚集体。在I型胶原上中进行培养时,血管内皮细胞也能够形成类似血管的管状结构。因此,I型胶原可应也适用于体外的血管生成实验发生分析。
  • 乳腺癌干细胞在I型胶原上中培养时会可发生分化。
  • I型胶原同样适已被用于原发性代结肠癌细胞系的培养;小鼠肝脏前体细胞和大鼠的胰岛细胞也可培养于3D的I型胶原中。
  • I型胶原可在细胞侵润实验分析中作为屏障,也可适已被用于细胞粘附的相关研究。

以下细胞类型通常培养于I型胶原中:

  • 内皮细胞(包括HUVEC)
  • 成纤维细胞
  • 肝细胞
  • 软骨细胞
  • 破骨细胞
  • 成骨细胞
  • 角质形成细胞
  • 角膜上皮

可用的酶包括:GibcoTrypLE Express酶,GibcoTrypLE Select酶或GibcoStemProAccutase细胞解离试剂(Cell Dissociation Reagent)。

I型胶原是以20 mM 乙酸溶液的液体形式来提供的。如果在准备过程中遇到困难,可先按1:2的比例将胶原稀释于20 mM,pH 3.5的乙酸中,之后再按依照所用的实验方案中的说明进一步稀释。

Recombinant Human Laminin-521 (rhLaminin-521)

Yes. To ensure optimum recovery of PSCs following single-cell passaging, PSCs should be fed with Essential 8™ Flex Medium the day before passaging.

The optimal working concentration of rhLaminin-521 is cell line dependent and must be determined empirically. However, for some cell lines, coating concentrations as low as 0.3 μg/cm2 can be used with no decrease in performance. Additionally, coating plates overnight at 4 degrees C can support coating concentrations as low as 0.1 μg/cm2.

We recommend that you leave the product on ice while prepping to use it.

Yes, you may use EDTA or versene. However, we do not recommend using dispase or collagenase as it can lead to differentiation.