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通用1D电泳

务必查看电源、装置或凝胶是否存在问题。通常,切换电源或开盖查看是否有连接错误可帮助解决问题。同时,检查缓冲芯是否有损坏。此外,应确认电泳槽中的缓冲液足以浸没凝胶的上样孔。

以下是可能原因和解决方案:

原因 解决方案
使用了浓度过高或错误的缓冲液 检查缓冲液配方;必要时,稀释或重新配制
电压、电流或功率设置过高 将电源条件降低至推荐的电泳条件

以下是可能原因和解决方案:

原因 解决方案
上样量太大 上样量不要过大
还原剂不新鲜 上样前正确还原样品,不要使用保存在还原剂中的样品
电泳过程中,蛋白质再氧化 使用NuPAGE™凝胶电泳时,在电泳缓冲液中加入抗氧化剂
存在高度疏水性区域,在此区域内蛋白质排斥SDS 上样时,使用2X样品缓冲液代替1X
样品含盐过多 沉淀,并使用低盐缓冲液重悬
样品中SDS不足 在上样缓冲区加SDS(尝试0.1%、0.2%、0.3%和0.4%)

杠铃形条带可能是由上样量过大所致。当上样量很大时,一部分样品会扩散到孔的边缘。电泳开始后样品通过浓缩胶部分,样品不完全浓缩会使扩散到孔边缘的部分样品出现轻微滞后。较大的蛋白质在低浓度丙烯酰胺的浓缩胶中迁移阻力更大,会加剧这种效应。为缓解这一问题,我们推荐浓缩蛋白质并减少上样量。这会形成“较薄的”起始区域。

出现“微笑”条带可能是因为凝胶中的丙烯酰胺分解,使蛋白质迁移的基质变少。我们建议您确认使用的凝胶未超过有效期。

凝胶脱离凝胶盒的原因可能是:

  • 过期的凝胶发生降解。
  • 凝胶保存方式不恰当。
  • 电泳期间,电流过大导致过多的热量积累。
  • 聚丙烯酰胺聚合不充分。

样品中可能含有过多β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)或样品缓冲液盐。如果蛋白质过度还原,会带有负电荷并在泳道间相互排斥,使条带在凝胶中下行时逐渐变窄。

部分蛋白质样品可能在电泳过程中再氧化,或在电泳前未完全还原。我们推荐使用新鲜的β巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)制备新鲜的样品溶液。对于NuPAGE™凝胶,我们推荐在电泳缓冲液中加入抗氧化剂。

可能原因为:

  • 上样孔周围的聚合较差
  • 样品的盐浓度较高
  • 凝胶界面不均匀
  • 凝胶安装到夹子上时,对凝胶板造成的压力过大
  • 凝胶加热不均匀
  • 凝胶中有不溶物质或整块凝胶上的孔径不一致
  • 电泳时有气泡

解决方法:

  • 采用透析、Sephadex™ G-25或任何其他脱盐柱或使用Amicon™浓缩管去除过多的盐或其他物质。
  • 电泳时,使用冷却装置或降低电流。

可能原因:

  • 上样错误,导致样品残留污染了相邻孔
  • 电泳缓冲液污染
  • 凝胶灌制错误:畸形孔

解决方法:

  • 使用凝胶上样器将样品加到孔中
  • 减少上样体积
  • 不要延迟上样
  • 不要延迟电泳,因为蛋白质会水平扩散;满孔与空孔相邻时,满孔会随时间推移而逐渐污染空孔。

可能原因:

  • 还原剂过多(β-巯基乙醇)
  • 皮肤蛋白至污染物(角蛋白)

解决方案:

  • 即将上样前,在平衡缓冲液中加入碘乙酰胺,该方法已被证明能消除这种人为条带。
  • 处理凝胶和上样时,使用新鲜的电泳溶液并戴手套。使用高度敏感的染料时,更易出现这种问题。

 

这可能是由凝胶聚合问题和错误的样品制备(最终样品稀释度低于1X)所致。请尝试使用不同批次的相同凝胶,并确保样品正确制备。

这可能是由于:

  • 孔中有碎片
  • 样品含盐量高(确保盐浓度不超过50–100 mM)
  • 电泳缓冲液存在问题
  • 制胶错误

以下是一些建议:

  • 检查使用的凝胶类型/凝胶百分比;使用错误的凝胶类型/凝胶百分比,所有条带都可能消失。例如,小分子量的蛋白质在非常低百分比的凝胶上不会分离,而高分子量蛋白质条带在高百分比凝胶上不会分离。
  • 检查蛋白质是否正确保存——不恰当的保存条件会使蛋白质降解。

以下是一些建议:

  • 确保每个泳道中的蛋白质上样量正确;蛋白质上样量过多会产生拖尾效应,使用银染凝胶特别容易出现这个问题。
  • 使用低百分比凝胶,条带分离不会很好;尝试使用较高百分比的凝胶。
  • 若转印/检测后,条带看起来拖尾和不清晰,可能是由于抗体浓度过高。应遵循生产商的稀释建议或通过点印迹法确定最佳的抗体浓度。

 

  • 上样时,注意确保相邻泳道间无交叉污染。
  • 确保没有上样过多的蛋白质;上样过多可导致出现其他条带,使用银染凝胶特别容易出现这个问题。
  • 不恰当的蛋白质保存方式或反复冻融会导致蛋白质降解。

Bolt™ Bis –Tris Plus凝胶

由于Bolt™凝胶现有的楔形孔设计,多余的聚丙烯酰胺(可能出现于梳子区域)是我们努力确保所有孔完全形成所造成的后果。将梳子竖直拉出凝胶孔,然后颠倒凝胶并轻轻将多余的凝胶擦到垃圾桶中,可去除大部分多余的物质。我们正在努力解决这个问题。

我们建议在将凝胶盒放入电泳槽之前,使用记号笔在凝胶盒上标记出孔的底部,从而增加上样孔与凝胶间的对比度。

以下是一些可能原因和解决方法:

  • 缓冲液从电泳槽内部泄漏到外部。泄漏最可能是由于凝胶盒移除不恰当,导致垫片没有正确安置,密封不良。我们建议用拇指向下推垫片。
  • 缓冲液未完全浸没上样孔。我们建议在插入凝胶盒之前,在电泳槽中加缓冲液至电极的高度。完全填满电泳槽不仅可以防止缓冲液向外泄漏,还能起到散热的作用。
  • 未将凝胶盒上的胶带移除。确保在将凝胶盒插入电泳槽前移除胶带。
  • 未将凝胶盒放到电泳槽底部就将其夹紧(这会使底部形成电流分流,导致凝胶电泳缓慢或不能电泳)。

以下是可能原因和解决方案:

原因
解决方案
缓冲液稀释过度
检查缓冲液配方;必要时,重新配制。
缓冲液槽泄漏
确保凝胶盒夹安置稳固,垫片在原位,且凝胶盒夹已锁定。
电流设置过低
设置正确的电流。

以下是可能原因和解决方案:

原因 解决方案
凝胶盒底部留有胶带
从凝胶盒底部移除胶带。
未完全与电源连接
使用电压表检测所有连接处的电导率。
缓冲液不足
确保电泳槽中的缓冲液足以浸没凝胶上的上样孔。

以下是可能原因和解决方案:

原因 解决方案
使用了浓度过高或错误的缓冲液 检查缓冲液配方;必要时,稀释或重新配制
电流设置过高

将电源条件降低至推荐的电泳条件

可能是因为Bolt™凝胶盒插反了(大塑料板朝前,上样孔朝后),尽管这很难实现。当凝胶反向插入时,电流从凝胶底端流向顶端,导致样品反向电泳。对调导线将转换凝胶电泳方向,但会导致电流从阳极流向阴极。阴极是由带有铂涂层的不锈钢制成,阳极是由铂丝制成。电子从阳极流向阴极,会导致钢芯生锈。但是,当正确连接导线时,电子从阴极流向阳极,铂丝作为电子受体则不会生锈。

注意:当凝胶盒正确插入时,凝胶盒上的印刷字体(凝胶类型、SKU和有效期)是反向的(从右向左阅读)。

以下是出现波浪形染色条带的可能原因和解决方案:

原因 解决方案
缓冲槽内外的缓冲液高度不同 两个电泳槽中的缓冲液必须全都加至电极的高度。这样不仅可以防止缓冲液从内向外泄漏,还能起到散热的作用,从而防止出现波浪形染色条带。
所用电泳缓冲液稀释度大于1X
我们推荐使用1X电泳缓冲液。
使用旧的电泳缓冲液 应确保使用新鲜的电泳缓冲液,并且不要重复利用电泳缓冲液。

NuPAGE™ Bis-Tris和NuPAGE™ Tris-Acetate凝胶

若使用了冷冻的NuPAGE™凝胶,可出现这种情况。请确保将NuPAGE™凝胶保存在4-25℃,并且不会发生意外冷冻。检查冰箱设置,将凝胶保存在下层架子上,远离冷冻层和冷凝器。

向前弥散表示抗体在凝胶上迁移过程中被还原。这可能是由于样品缓冲液中加入了抗氧化剂或在加热NuPAGE™样品缓冲液时发生二硫键重排。应确保样品缓冲液中加入了正确浓度的还原剂并且未加入任何抗氧化剂。

我们不推荐使用冷冻过的NuPAGE™凝胶,因为:

  • 凝胶会变得易碎,可能在电泳前后或在染色液中破裂。
  • 可能导致在电泳过程中形成气泡,并在中间泳道中出现部分条带扭曲。

RIPA缓冲液含有大量去污剂,因此,不能与NuPAGE™凝胶兼容。

对于大于100 kDa的蛋白质,我们建议在安装“三明治”前,将凝胶置于含有0.02–0.04% SDS的2X转膜液(无甲醇)中预平衡10分钟,然后使用含甲醇和0.01%SDS的1X转膜液进行转膜。

以下是可能原因和解决方案:

原因
解决方案
缓冲液稀释过度 检查缓冲液配方;必要时,重新配制。
上样缓冲区泄漏 确保凝胶盒夹安置稳固,垫片在原位,且凝胶盒夹已锁定。
电压设置过低 设置正确的电压。

我们建议在安装上样缓冲区之前,使用记号笔在凝胶盒上标记出孔的底部。此外,我们也推荐将光源正确放置在XCell SureLock™装置后方,照亮实验台区域。

  • 再次检查凝胶底部的胶带是否移除。
  • 确保凝胶安装方向正确,即凝胶盒较高的一面(有印刷字体)面向电泳装置的外侧。
  • 确保在缓冲液槽内部加入了足够的缓冲液,可浸没上样孔。若未浸没上样孔,检查是否有泄漏并重新封装。
  • 再次检查电极或Mini cell装置的连接处是否有松动。
  • 检查电源。

Tris-甘氨酸凝胶

若使用了含抗氧化剂NuPAGE™电泳缓冲液进行Tris-甘氨酸凝胶电泳,可能出现这种情况。请确保在Tris-甘氨酸凝胶电泳时使用正确的Tris-甘氨酸电泳缓冲液。

以下是可能原因和解决方案:

原因
解决方案。
缓冲液稀释过度 检查缓冲液配方;必要时,重新配制。
上样缓冲区泄漏 确保凝胶盒夹安置稳固,垫片在原位,且凝胶盒夹已锁定。
电压设置过低 设置正确的电压。

我们建议在安装上样缓冲区之前,使用记号笔在凝胶盒上标记出孔的底部。此外,我们也推荐将光源正确放置在XCell SureLock™装置后方,照亮实验台区域。

  • 再次检查凝胶底部的胶带是否移除。
  • 确保凝胶安装方向正确,即凝胶盒较高的一面(有印刷字体)面向电泳装置的外侧。
  • 确保在缓冲液槽内部加入了足够的缓冲液,可浸没上样孔。若未浸没上样孔,检查是否有泄漏并重新封装。
  • 再次检查电极或Mini cell装置的连接处是否有松动。
  • 检查电源。

使用NuPAGE™ Novex™ Bis-Tris凝胶/小肽附带的实验方案,可能会降低背景。该实验方案包含额外的固定步骤以除去多余的SDS,SDS是一种抗胶体试剂,可导致较高背景。染色液的低pH条件可固定凝胶,但没有NuPAGE™实验方案特有的预固定步骤速度快。

丙烯酰胺比例低于10%的凝胶具有较大的孔,胶体会渗透入孔并将其封闭,从而产生较高的背景。为降低过高的背景,可将凝胶在25%甲醇溶液中孵育,直至获得清晰的背景。应注意,这样做会部分去除条带上的染料,在>25%甲醇溶液中长时间孵育会导致蛋白质条带和背景完全脱色。

Thermo Scientific™ Precise™蛋白质凝胶

以下是可能原因和解决方案:

原因
解决方案
上样孔、凝胶和凝胶盒之间或凝胶盒底部存在气泡
使用移液器从上样孔中移走气泡。
样品含有一定量的糖

通过酶催化或化学方法去除糖。
样品含有脂蛋白 使用顶部为大孔径的凝胶。尝试加入非离子去污剂。

以下是可能原因和解决方案:

原因
解决方案
样品中含有溶解度差或带有轻微电荷的颗粒(如糖) 离心样品。
调节缓冲液的pH。
加入含有SDS的样品。

以下是可能原因和解决方案:

原因
解决方案
凝胶选择和上样量错误,以及缓冲液冷却不充分 选择能够分离期望分子量范围的凝胶。
减少上样量。
增加外侧电泳槽中的缓冲液。
对于分子量相近的蛋白质,可能需要2D分离。

以下是可能原因和解决方案:

原因
解决方案
样品含盐过多 通过透析或超滤降低盐含量。
蛋白质上样量过多 优化蛋白质上样量。

这可能是样品加热过度所致。我们推荐使用预冷缓冲液(<15℃)。

以下是可能原因和解决方案:

原因
解决方案
凝胶上仍含有SDS 使用超纯水彻底清洗凝胶(3 X 5分钟),并使用30%甲醇对凝胶进行脱色处理。
蛋白质条带扩散 使用10%TCA固定凝胶中的蛋白质。

请确保使用这些凝胶时,使用了Tris-HEPES SDS电泳缓冲液。Precise™ Tris-HEPES 凝胶专门与Tris-HEPES SDS电泳缓冲液一起使用,以获得最佳的速度和分辨率。我们不推荐使用Tris-甘氨酸SDS电泳缓冲液,因为这会导致较差的迁移和条带分辨率。