Rasterelektronenmikroskopie mit Plasma-fokussiertem Ionenstrahl

Gründe für die Verwendung von PFIB-REM in der Volumenelektronenmikroskopie 

Die Rasterelektronenmikroskopie mit Plasma-fokussiertem Ionenstrahl (Plasma-FIB-REM) kombiniert eine verbesserte Sputtereffizienz mit einer Bildauflösung im Nanometerbereich entweder bei Raumtemperatur oder unter Kryobedingungen. Dies ermöglicht einen schnellen Zeigeverlauf während der 3D-Bildgebung. Mehrere Ionenspezies (Xe, O, Ar und N) sind vielseitige Optionen für die ortspezifische Entfernung großvolumiger Materialien. So bietet beispielsweise die O+-PFIB eine hervorragende Datenerfassung und Bildqualität bei Proben, die in Epoxid- oder Acrylharze eingebettet sind. Im Gegensatz zu FIBS auf Ga-Basis lassen sich problemlos verwischungsfreie Oberflächen für eine Vielzahl von Materialien wie LR-White, HM20 und EPON-Harze erzeugen. Die hervorragende Kompatibilität mit Kunstharzen und Proben ermöglicht eine gezielte FIB-REM-Tomographie mit direkter, korrelativer Bildgebung des Untersuchungsbereichs (Region of Interest, ROI). Die Ausrichtung auf den ROI kann durch die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) noch weiter verbessert werden. Das Datenmanagement der Schnitte erfolgt automatisch.

3D-Volumen eines Mausneurons mit synaptischen Vesikeln und Mitochondrien-HPF (gefärbt) in EPON.

Wie funktioniert PFIB-REM in der Volumenelektronenmikroskopie?

Das Thermo Scientific Helios 5 Hydra DualBeam ist ein vielseitiges Gerät für die durchsatzstarke zelluläre FIB-REM-Tomographie und kompatibel mit allen gängigen Probeneinbettmedien und Vorbereitungsprotokollen. Vier Ionenspezies (Xe, O, Ar und N) können unabhängig voneinander für den ortsspezifischen, großvolumigen Materialabtrag für Top-down- und Querschnittsanalysen in 2D und 3D verwendet werden. Durch die Auswahl des Ionenstrahls entsprechend den Anforderungen jeder einzelnen Probe kann bei komplexen Proben eine hervorragende Oberflächenstruktur erreicht werden, einschließlich Proben-Substrat-Schnittstellen und zahnmedizinischer Materialien (mineralisiertes Gewebe).

 

Ein Plasma-FIB ermöglicht dank eines breiteren, gebündelten Strahls, der um bis zu 2,5 μA höhere Ströme liefert als ein Ga-FIB, eine effiziente, serielle Schnittdarstellung großer Volumina. Die höhere Sputtereffizienz verbessert die Leistung, erzeugt gleichmäßigere Schnittflächen und reduziert Verwischungsartefakte, verbessert den Durchsatz und ermöglicht einen schnellen Zugang zum Untersuchungsbereich. Die Kombination aus höheren Strömen, höheren Sputterraten und geringeren Schäden macht es möglich, auf Volumina von Hunderten von Mikrometern Größe zuzugreifen und dennoch Merkmale im Nanobereich zu beobachten.

PFIB-Spin-Mill-Methode für planares Fräsen und die Bildgebung großer Flächen

Die optionale Spin-Mill-Methode auf dem Helios 5 Hydra DualBeam ermöglicht das großflächige planare Fräsen mit einem Durchmesser von bis zu 1 mm und die Abbildung großer Bereiche in einer horizontalen Ebene zur 3D-Charakterisierung. Der Spin-Mill-Prozess ist vollautomatisch und lässt sich einfach mit der Thermo Scientific Auto Slice & View Software einrichten. Innerhalb eines Spin-Mill-Experiments können mehrere Bereiche für die Bilderfassung ausgewählt werden. Jeder Untersuchungsbereich kann je nach Spezifität des Experiments mit unterschiedlichen Bildgebungseinstellungen abgebildet werden. 

 

Bei der Spin-Mill-Methode werden die Proben nahezu im Glanzwinkel mit PFIB gefräst. Eine sonst typische Probenvorbereitung (z. B. Trenching, Anbringen von Schutzkappen, oder Referenzmarkierungen) ist nicht erforderlich. Bei einem solch großen Fräsbereich können zahlreiche Regionen ausgewählt und abgebildet werden. Spärliche Eigenschaften sind leicht auszumachen, und statistisch relevante 3D-Daten können aus mehreren Bereichen erfasst werden.

Korrelative Mikroskopie vereint PFIB-REM mit der Fluoreszenzmikroskopie

Das Thermo Scientific iFLM Correlative System ist ein integriertes Weitfeldmikroskop zur kryokorrelativen Bildgebung innerhalb des Helios 5 Hydra PFIB. Es ermöglicht Ihnen, die Fluoreszenzbildgebung in einem einzigen Mikroskop mit dem Ionenfräsen zu kombinieren, um eine korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) bei Raumtemperatur oder unter Kryobedingungen durchzuführen.

Galerie von 3D-Beispielen der PFIB-REM

Maus-Hippocampus, aufgenommen mit der Spin-Mill-Methode

Mit der Spin-Mill-Methode können große Bereiche bearbeitet werden, um hochauflösende Probendetails zu erhalten, die mit Fokus auf den Untersuchungsbereich weiter analysiert werden können. Organtypische Schnitte des Maus-Hippocampus HPF Gefrierharz EPON. Mit freundlicher Genehmigung von S. Watanabe, John Hopkins University, und J. Wang, Thermo Fisher Scientific.

Lernen Sie die Wissenschaftler kennen, die PFIB-REM in der Volumenelektronenmikroskopie verwenden

„Wir müssen unbedingt mehr darüber erfahren, wie wir Getreide widerstandsfähiger gegen Umweltbelastung und Krankheiten machen können. Dank seiner bemerkenswerten Eigenschaften ermöglicht es unser neues Hydra vEM, ganze Pflanzenzellen und Pflanzengewebe hoch detailliert zu rekonstruieren. Mit dieser Technologie können wir Organismen in Zeit und Raum „einfrieren“ und komplexe 3D-Modelle erstellen, die uns helfen werden, unsere kritischen Herausforderungen im Bereich der Nahrungssicherung zu lösen.“

 

Kirk J. Czymmek, Principal Investigator, Direktor des Advanced Bioimaging Laboratory, Donald Danforth Plant Science Center

PFIB-REM-Ressourcen

Das Thermo Scientific Helios 5 Hydra DualBeam ist ein vielseitiges PFIB-REM mit mehreren Ionenspezies zur Analyse mittels Volumenelektronenmikroskopie.

Bei der Vorbereitung biologischer Proben für die Analyse bestimmen die Probenvorbereitungsmethode und der Harztyp, wie gut subzelluläre Strukturen und Fluoreszenzsignale erhalten bleiben.

In diesem Anwendungshinweis beschreiben wir die Spin-Mill-Methode für großflächiges planares Fräsen mit Sauerstoff-PFIB zur Ansteuerung und Untersuchung großer Flächen (bis zu 1 mm).

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.