Principes fondamentaux de la HPLC

Chromatographie en phase liquide à haute performance

Les méthodes de chromatographie en phase liquide à haute performance sont développées sur des particules de phase stationnaire de 3 à 5 µm et fonctionnent à des pressions de fonctionnement allant jusqu’à 600 bars avec des débits compris entre 1 et 2 ml/min. La HPLC standard est le type de chromatographie liquide le plus utilisé dans diverses industries.

• La HPLC s’utilise généralement dans les processus d’assurance et de contrôle de la qualité des petites et grandes molécules dans les domaines de la pharmacie, de la chimie industrielle et de la sécurité alimentaire.

Chromatographie liquide ultra-haute performance

Les méthodes de chromatographie liquide ultra-haute performance (UHPLC) sont basées sur des particules de phase stationnaire de <2 µm et fonctionnent à des pressions fonctionnement comprises entre 600 et 1 200 bars avec des débits de 0,2 à 0,7 ml/min. Cette plage de pression accrue offre une meilleure résolution et sensibilité, un débit plus élevé et une utilisation moindre de solvants par rapport aux systèmes de HPLC standard. La méthode UHPLC augmente les capacités de la HPLC traditionnelle en permettant aux utilisateurs d’utiliser des colonnes et des particules de diamètre interne plus petit et d’effectuer des analyses plus rapides.

• La méthode UHPLC s’utilise principalement dans les laboratoires de recherche et de développement et dans les domaines pharmaceutique et biopharmaceutique pour le développement et la caractérisation de médicaments à petites molécules, de peptides et d’anticorps.

Chromatographie liquide - spectrométrie de masse

La méthode de chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) utilise un spectromètre de masse au lieu d’un détecteur optique traditionnel tel qu’un détecteur UV-Vis. Dans ce cas, le rapport masse / charge de l’analyte est mesuré au lieu des propriétés optiques.

• L’analyse des peptides et des protéines fait partie des tâches routinières des méthodes LC-MS.

Chromatographie liquide préparative

Les techniques de LC préparative consistent à collecter l’éluant fractionné dans des conteneurs d’échantillons distincts pour isoler un ou plusieurs analytes afin de purifier les composants principaux ou d’isoler les impuretés en vue d’investigations ultérieures. Les séparations LC préparatives se répartissent en trois catégories : Analytique, semi-préparative et préparative. L’objectif de la séparation détermine l’échelle, la taille de la colonne et le débit.

• Les séparations LC préparatives sont destinées à la purification à grande échelle de composants de masse et sont souvent utilisées à des fins de fabrication. Les colonnes ont généralement un diamètre intérieur de 50 à 200 mm et sont utilisées à des débits de >50 ml/min. 
• La LC semi-préparative s’utilise notamment dans la purification à petite échelle pour la fabrication et les flux de travail de caractérisation tels que l’isolement de composés pour l’analyse structurelle. Les colonnes ont un diamètre intérieur de 10 à 30 mm et fonctionnent à des débits compris entre 5 et 50 ml/min.
• Les purifications à l’échelle analytique sont utilisées dans les processus en amont et en aval, comme l’amélioration du rendement des produits ou l’isolement de composés purs pour les caractérisations cryo-EM. Les colonnes et les débits sont inférieurs à 4,6 mm et 2 ml/min, respectivement.

Chromatographie liquide bidimensionnelle

La chromatographie liquide bidimensionnelle (2D-LC) est une technique de séparation avancée qui utilise deux chimies de colonne complémentaires en série pour une séparation multidimensionnelle au lieu de faire passer l’échantillon par une seule colonne. Les chromatographes peuvent utiliser trois types uniques de méthodes 2D-LC pour améliorer la résolution des échantillons en utilisant la sélectivité de plusieurs colonnes.

• Les applications de la 2D-LC peuvent s’appliquer à des mélanges chimiques complexes tels que les vaccins et les aliments avec des matrices d’échantillons interférentes.

Chromatographie liquide double

La chromatographie liquide double est une méthode HPLC multicanaux qui utilise deux voies d’écoulement distinctes dans un seul système pour effectuer deux analyses simultanément. Ces systèmes HPLC possèdent deux pompes avec deux voies de solvants indépendantes, deux unités de dosage à l’intérieur de l’échantillonneur automatique et deux détecteurs, tout en conservant l’encombrement d’un seul système de HPLC.

• Les méthodes LC doubles sont utiles dans toutes les situations où vous avez besoin d’augmenter le débit de vos échantillons, comme l’analyse d’un échantillon pour les pesticides résiduels et le contenu phénolique en une seule fois ou l’exécution simultanée d’analyses répétées.

Chromatographie liquide en tandem

Les techniques de chromatographie liquide en tandem utilisent une deuxième pompe et une commutation intelligente des colonnes pour maximiser l’utilisation du détecteur en minimisant les temps d’arrêt liés au reconditionnement des colonnes. Le gradient en tandem s'exécute en deux parties principales : La pompe 1 délivre le gradient analytique à la colonne 1 tandis que la pompe 2 reconditionne. La pompe 1 délivre alors le gradient analytique à la colonne 2 tandis que la pompe 2 reconditionne la colonne 1.

• Les méthodes de LC en tandem s’utilisent principalement dans des applications telles que la sélection de têtes de série pour les laboratoires de découverte de médicaments afin d’augmenter le débit d’échantillons et de maximiser l’utilisation des détecteurs.

Chromatographie liquide à gradient inverse

Une modification de la composition organique au cours d’une élution de gradient peut faire varier la réponse de l’analyte pour certains détecteurs, comme la détection d’aérosols chargés, et compliquer l’analyse. L’application post-colonne de la compensation de gradient inverse élimine cet effet en garantissant que l’éluant qui entre dans le détecteur conserve la composition exacte du solvant pendant toute la durée de la séparation par gradient.

• Les séparations par gradient inverse sont appliquées exclusivement lors de l’utilisation d’un détecteur d’aérosols chargés et sont utilisées dans le domaine pharmaceutique, où la quantification des impuretés dans les médicaments est essentielle.

Le principe de séparation de la HPLC repose sur la répartition des composés de l’échantillon entre une phase mobile (provenant de la pompe) et une phase stationnaire (dans une colonne). Lors de leur passage dans la colonne, les groupes de composés interagissent différemment avec la phase stationnaire et sont retenus en fonction de leurs propriétés chimiques, d’où la séparation.

Une pompe délivre la phase mobile à travers une colonne remplie d’une phase stationnaire. Un échantillonneur automatique injecte l’échantillon dans la colonne. La phase stationnaire sépare les composés de l’échantillon ou les analytes. Un détecteur mesure les analytes après la séparation et l’élution de la colonne.