玩转细胞分离，效率提升so easy

随着细胞治疗、单细胞测序等领域的快速发展，自动化细胞分离正成为提升实验效率与结果稳定性的关键趋势。赛默飞Invitrogen™ Dynabeads™磁珠以其卓越的细胞捕获性能，搭配KingFisher™全自动磁珠纯化系统，可轻松实现从手工到自动化工作流程的升级——不仅大幅减少人工操作时间，更能确保高通量样本处理的高度一致性。可是，分离过程中难免会遇到一些问题，导致分离出的细胞纯度不够或者活性不高。

为了帮助大家解答这些疑问，Doctor. D再次上线，化身实验技能满分的大师兄，带您探讨和优化细胞分离过程中的实验细节，干货满满，快搬上小板凳，咱们一起先睹为快！

细胞分离的孵育时间优化

在细胞分离过程中，目标细胞与磁珠结合的孵育时间通常因使用者而异。为了确定进行高效阳性分离所需的孵育时间，我们使用Jurkat 细胞作为起始材料。Jurkat细胞分别与Dynabeads磁珠孵育10分钟、20分钟、30分钟和60分钟（图1）。通过流式细胞仪测量去除部分的剩余细胞，从而估算分离效率。结果表明，使用 KingFisher 仪器进行 20 分钟或 30 分钟孵育的分离效率与手动分离相当。有趣的是，数据显示大部分的结合发生在最初的 10 分钟内，将孵育时间从 30 分钟延长到 60 分钟并没有提高分离效率。

图1. 分离 CD3阳性Jurkat 细胞的孵育时间。使用 KingFisher Duo Prime 仪器将 Jurkat 细胞与 Dynabeads CD3 分别孵育 10 分钟、20 分钟、30 分钟或 60 分钟。将细胞分离结果与手动方法进行比较。流式细胞仪用于估算分离效率。

细胞分离的混合条件优化

为了避免目标细胞丢失并确保高产量，在细胞分离步骤中选择合适的混合条件同样至关重要。为了确定合适的混合条件，我们在 KingFisher 仪器上测试了三种混合速度：慢速（基线）、中速和快速。在中速和快速混合速度下，细胞会大量丢失（图2）。此外，剩余细胞的存活率也有所降低。在低速混合时，分离效率和细胞活力与手动分离大致相同。因此，为了获得高产量和高活力的分离细胞，在分离过程中应轻柔地混合样品。

图2. 分离 CD3阳性Jurkat 细胞的混合条件。以慢速、中速或快速混合速度将 Jurkat 细胞与 Dynabeads CD3 孵育 30 分钟。细胞分离结果与手动方法的结果进行了比较。流式细胞仪用于估算分离效率。

细胞分离后的磁珠捕获优化

在细胞分离中，为了尽可能去除不需要的细胞，通常需要通过去除所有与磁珠结合的细胞来实现。在此，我们比较了捕获一次（1x）磁珠结合细胞后的去除效率与循环捕获两次（2x）和三次（3x）磁珠结合细胞后的去除效率。结果表明，增加一个捕获步骤的去除效果等同于或优于手动分离（图3）。

图3. 磁珠去除效率。使用 KingFisher 仪器将 Jurkat 细胞与 Dynabeads CD3 一起孵育 30 分钟。收集磁珠捕获 1 次、2 次或 3 次的细胞，并将分离效率与手动方法进行比较。流式细胞仪用于估算分离效率。

通过使用Jurkat细胞进行实验方案优化，最终发现孵育时间为 30 分钟，缓慢混合，然后进行两个循环的磁珠捕获，这样的分离效率等于或优于手动方法。

随后我们将这个优化方案用于从更具生物相关性的材料（如 PBMC）中分离目标细胞。使用 KingFisher 仪器从几名献血者身上分离 T 细胞（CD3、CD4、CD8）、单核细胞（CD14）和 B 细胞（CD19）亚群。接着，对分离出的T细胞进行裂解和处理，使用与 CD81 抗体连接的 Dynabeads Protein G 磁珠捕获 CD81，随后进行免疫印迹检测分析。数据清楚地显示了CD81蛋白的存在（图4）。