多重免疫分析指南：多重ELISA及更多

多重免疫分析，包括多重ELISA，是研究人员同时分析多个生物标志物的强大工具。

本指南探讨了多重ELISA及其他多重免疫分析技术的原理、应用和优势。

什么是多重免疫分析？

多重免疫分析是一种先进技术，广泛应用于生物医学研究，可在单个孔中同时检测多个分析物（如蛋白质、肽或抗体），所需样本量极小（如1-50微升），适用于血浆、血清、细胞培养上清液或其他体液。通过一次检测多个生物标志物，这些方法能比传统的单一分析物检测提供更全面的生物过程和疾病状态信息，尤其在样本量有限时具有重要价值。

酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种常见且广泛使用的方法，用于样品分析，并能以高特异性和高灵敏度准确检测和定量单个蛋白质。ELISA的选择性通过合格的单抗或双抗夹心技术实现，准确定量则依赖于校准标准。ELISA通常采用96孔板格式进行，结果一般在约4小时后即可获得微孔板读数仪。使用ELISA获得的结果通常具有良好的重复性，并且与生物学相关的灵敏度水平和动态范围一致。

虽然ELISA是一种广泛可信的蛋白分析方法，但多重检测方法能够在单个孔中同时测量多个分析物，所需样本量更少，操作时间更短，有助于缩短出结果时间、降低成本和劳动强度。

多重免疫分析的常见研究应用

多重免疫分析广泛应用于各类研究领域，包括：

• 生物标志物发现：识别疾病的新生物标志物。
• 免疫反应研究：了解免疫系统对感染或治疗的响应机制。
• 药物和疫苗开发：测量治疗前后炎症反应和细胞因子反应
• 临床诊断：用于疾病的诊断与监测。
• 药效学与毒理学研究：评估药物的作用及其安全性。

免疫分析有哪些不同类型？

目前有几种类型的多重免疫分析方法，以下介绍三种。

电化学发光免疫分析（ECLIA）

电化学发光（ECL）分析法结合了电化学和化学发光原理，可用于检测多种分析物。该方法具有高灵敏度和宽动态范围，非常适合需要对低丰度生物标志物进行精确定量的应用。

Olink PEA（探针扩增检测）

The Olink邻近延伸分析（PEA）是一种高度特异性和高灵敏度的技术，利用带有DNA标签的抗体对来检测蛋白质。当抗体与其靶标结合时，它们的DNA标签会靠近并被延伸，从而可以通过qPCR或下一代测序（NGS）进行后续定量。Olink PEA能够以高特异性和高灵敏度同时检测多达5,000种以上的蛋白质。

Luminex / 基于微球的分析

Luminex® xMAP®（多分析物分析）技术使用带有不同浓度荧光染料编码的微球，通过这些不同浓度产生易于区分的微球集合（见图1A）。每组微球都包被有特异性抗体，用于捕获一个目标分析物，或者在双报告基因实验中，在同一颗微球上捕获两个不同的目标。

样品中被捕获的分析物通过与之结合的特异性生物素化抗体进行检测，该抗体可结合到固定分析物的相应表位上，并配合链霉亲和素-缀合R-藻红蛋白（S-RPE）或用于双报告基因实验的链霉亲和素-BV421进行检测。

用于免疫分析夹心复合物的检测，Luminex™ 仪器可采用发光二极管（LEDs）激发每个荧光微球，并结合CCD相机进行微球及分析物检测（MagPix，已停产），或者采用流式检测系统，通过红色和绿色激光分别激发每个荧光微球并测量报告染料信号（Luminex 200、FLEXMAP 3D、INTELLIFLEX、INTELLIFLEX DR-SE），以及在双报告基因实验中使用额外紫色激光测量第二个报告信号（仅适用于INTELLIFLEX DR-SE）。使用发光二极管（LED）对每个荧光微球进行激发，并结合CCD摄像头进行微球和分析物检测（MagPix，已停产）；或者采用基于流式的检测系统，利用红色和绿色激光对每个荧光微球进行激发并测量报告染料（Luminex 200、FLEXMAP 3D、INTELLIFLEX、INTELLIFLEX DR-SE），以及在双报告试剂盒中通过额外的紫色激光测量第二种报告染料（仅适用于INTELLIFLEX DR-SE）。

这种Luminex技术非常灵活，可用于检测蛋白质和核酸，因此它是一个双重功能平台适用于研究中的广泛应用。由于每种包被微球都能针对特定分析物进行单独识别，可以组合多种微球同时测量最多500个核酸目标以及通常不超过80个蛋白质目标（因生物学干扰）在单一样品中。因此，这种基于微球的方法实现了高通量和灵活的多重检测。

何时使用多重ELISA

虽然ELISA是可靠的蛋白质分析方法，但能够在单个孔中同时测量多个分析物的多重检测方法解决了许多具体限制：

• ELISA只能在给定样品中一次测量一个分析物，限制了研究人员对蛋白质相互作用进行全面生物学理解时对多个目标测量日益增长的需求。
• 可用的样本体积有限，可能会限制分析的次数。这在小动物研究、儿科检测以及微孔板检测中尤为明显，因为这些情况下提供的样本量有限。能够在单一样本中检测多种分析物，可以更有效地利用每一份样本。
• 当比较通过多个ELISA测得的分析物水平时，数据解释可能会遇到困难，因为每个检测都是用不同的样本等分进行，并且每个检测都可能受到系统误差的影响，从而导致精确度和准确度降低。
• 许多分析物需要具有宽动态范围的检测方法，以避免重复测试或出现超出范围的数值。多重检测可以设计成对所有分析物都具有较大的动态范围，或者根据预期分析物浓度定制客户所需范围。

对血清、血浆、细胞裂解液或尿液等特定蛋白质的分析，是炎症、代谢、细胞信号传导、癌症、心血管疾病、毒理学、神经科学及其他众多研究和临床领域研究的关键。不断增长的细胞因子、趋化因子及其他生长和分化因子的名单，以及它们在健康与疾病中的复杂相互作用网络，使得以相关群组而非单独评估它们变得至关重要。例如，在某一通路内，细胞因子或趋化因子之间水平的相互关系通常比它们是否存在，或者单个蛋白质的绝对水平更具意义。

Luminex™ xMAP™ 检测方法已被越来越广泛地用于样本分析，目前已有超过98,000篇科学文献证明其高精确性和可重复性。这些研究涵盖了广泛常见应用，包括：

• 测量人类、猴子、小鼠、大鼠、猪、犬及其他物种血清、血浆、尿液、脑脊液（CSF）、灌洗液体、细胞培养上清液及其他类型样本中的可溶性分析物。
• 基础研究——体外和体内研究
• 临床前研究——体外和体内模型
• 筛选一批血清以检测特定标志物或介质的存在/缺失
• 对通过蛋白质组学或基因组学分析确定的靶点数据进行定量确认

Invitrogen™ ProcartaPlex™ 多重免疫分析试剂盒基于Luminex xMAP技术，提供了一个多功能平台，为用户在分析物检测方面带来更多灵活性和更丰富的选择。

无论您是检测单一还是多个分析物，ProcartaPlex多重检测方法都能通过高效、易于操作的流程提供准确的分析性能。这些检测方法由ELISA专家开发，并经过严格的开发、验证、生产和质量控制流程，其标准与我们的Invitrogen ELISA相当。

此外，多重检测还会进行额外测试，以确保各项检测之间不存在串扰。每个ProcartaPlex多重检测和ELISA检测均针对所声明的样本类型（如特定物种血清、血浆和细胞培养上清液）进行了全面认证，每批产品都会根据以下性能特征进行评估：

• 特异性—每对抗体在开发过程中都经过充分测试，以确保其能够识别正确的分析物且不会与其他分析物发生交叉反应
• 灵敏度—每个分析物都会评估其功能灵敏度（与背景区分能力）以及最低检出限（LLOD）
• 精密度/准确性—多重检测具有良好的批内精密度（<15% CV）、批间精密度（<15% CV）以及批次间一致性（<30% CV）

为了展示多重检测的优势，分析了30个样品：23个未处理的人血清样品和7个用100ng/ml LPS处理20小时的血浆样品。低表达靶标的表达模式如下图所示。数据由以下方法生成：Invitrogen™ ProcartaPlex™ 人类免疫反应面板，80plex。

多重免疫分析与ELISA：相似性与差异

结果质量与可重复性

多重免疫检测和传统ELISA都能提供高质量结果。然而，多重免疫检测能够同时测量多个分析物，从而提供更全面的数据，有助于深入理解复杂生物系统。如果检测方法经过充分验证，不同实验之间也能保持良好的重复性。

操作难度与耗时

多重免疫分析的设置和优化比单一分析物的ELISA更为复杂。然而，一旦建立起来，它们可以显著节省时间，因为能够同时测量多个目标。这减少了所需的实验次数，并加快了数据生成速度。

成本

虽然多重免疫分析的初始设置和试剂成本可能高于单一分析物ELISA，但由于所需实验和样品数量减少，每个分析物的总体成本通常更低。随着检测分析物数量的增加，性价比也随之提升。

多重免疫分析的优势总结

Luminex 多重微球 ProcartaPlex 免疫分析与传统 ELISA 技术相比具有许多显著优势，包括：

• 节省时间—ProcartaPlex 检测可以在单一样本中测试多达 80 种分析物。在设置一次 ELISA 所需的时间内，可以检测多个分析物，显著减少了人工操作时间。
• 更小的样本体积—根据表达水平，多重检测只需 25-50 微升样本或更少（384 孔板格式），同时仍能获得所有分析物的准确结果。
• 宽广的动态范围—能够可靠地检测跨越广泛浓度范围的蛋白质。
• 高通量—Luminex系统可读取常规的96孔和384孔微量滴定板。结合每个样本最多可检测80种分析物的能力，这为数据收集提供了高通量的途径。

现场应用专家（FAS）可以为您讲解多重检测技术，回答问题，并协助支持运行和分析Invitrogen多重检测实验的各个方面。如有任何疑问，请联系我们：LuminexFAS@thermofisher.com或访问Multiplex Academy（多重检测学院）自学平台。

在此博客中了解更多产品信息：

Luminex和ProcartaPlex免疫分析的资源与解决方案

• Luminex平台 – 具有卓越通量的定量蛋白和RNA分析
• Luminex仪器与检测指南——高通量多重蛋白及基因表达分析
• ProcartaPlex面板配置器 – 此在线工具可帮助您为特定应用设计自定义多重检测面板
• ProcartaPlex检测支持 – 浏览“入门指南”和“故障排除”部分，获取热门咨询和常见问题的解决方案。

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