HPLC基础知识：你应该了解的内容

在当今的分析实验室中，你几乎不可能找不到一台高效液相色谱（HPLC）仪器，因为它在医药、食品饮料、制造和环境安全等众多领域中都扮演着至关重要的角色。

这篇博客文章解释了什么是高效液相色谱（HPLC）、其工作原理，以及液相色谱仪用于纯化混合物的不同技术。

什么是HPLC？

HPLC是一种广泛应用于分析化学的技术，用于分离、鉴定和定量化学混合物中的化合物。这些分离过程利用流动相在压力驱动下通过填充有固定相的色谱柱进行。

流动相将液体样品带入色谱柱并输送到检测器，不同化合物——即分析物——由于与固定相作用力的不同而实现分离。

检测器在分析物从色谱柱洗脱后对其进行测量，色谱数据系统（CDS）则将检测到的信号进行转换。

HPLC分析的翻译数据输出称为色谱图，其中x轴表示时间，y轴是由检测器产生的特定信号。

图1. HPLC色谱图示例。

HPLC是如何工作的？

一台HPLC仪器通常有四个主要硬件组成部分：泵、自动进样器、色谱柱和检测器。其他部件包括溶剂、CDS软件包，以及连接毛细管和管路，以便流动相和样品在系统中持续流动。

每次HPLC分析都包括以下步骤：

1. 流动相开始流动— 泵以指定的流速将洗脱剂推送通过系统。
2. 样品进样— 样品注入到流动相后，会随流动相从进样点移动到色谱柱头部。
3. 化合物分离— 化合物的物理分离发生在柱子的固定相上。样品组分从柱子洗脱后，分离的组分会进入检测器。
4. 分析物检测— 基于特定属性产生的电信号来检测指定的分析物。
5. 色谱图生成— CDS将检测到的分析物信号转换为分析物信号与时间关系的色谱图。

图2：高效液相色谱仪器示意图。

哪些因素影响HPLC分离？

许多因素，如流动相组成、柱子化学性质和温度，都可以影响HPLC分离。如果分析物对柱子的亲和力不同，才能实现成功分离，因此选择适合你化合物的固定相至关重要。

影响整体分离过程的主要因素有：

• 分析物的理化性质，如大小、电荷、极性和挥发性
• 固定相的理化性质，如极性、电荷和黏度
• 所用流动相的理化性质及其与分析物和固定相的相互作用

等度分离与梯度分离

所有HPLC分离都以两种模式之一进行——等度或梯度。

• 等度方法在分析过程中使用恒定的洗脱剂组成进行分离，例如100%乙腈或50:50乙腈与水的混合物。
• 梯度方法则是在分离过程中改变流动相组成。这些方法通常使用两种溶剂，称为A和B。例如，实验开始时A:B为60%水对40%乙腈，随后在分离过程中比例发生变化。

图3. 等度洗脱与梯度洗脱的示意图。

液相色谱技术类型

鉴于化合物数量众多且潜在分析物结构多样，HPLC很少采用一刀切的方法。从纳升级到制备级分离，以下是最常见的HPLC技术类型及其适用场景列表。

液相色谱技术	工作原理	应用
高效液相色谱	HPLC（高效液相色谱）在压力低于700巴、流速为1–2毫升/分钟的条件下运行	用于制药、工业化学品和食品安全领域中小分子和大分子的质量保证/质量管理（QA/QC）
超高效液相色谱	UHPLC（超高效液相色谱）采用超过1000巴的压力，流速为0.2–0.7毫升/分钟。较高的压力范围可提供更好的分辨率和灵敏度、更高的通量，以及比标准HPLC系统更少的溶剂消耗	通常应用于研发实验室以及制药和生物制药领域，用于小分子药物、肽类和抗体的开发与表征
液相色谱-质谱联用技术	液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）采用了质谱仪而不是传统的光学检测器，如紫外-可见检测器	主要用于肽类和蛋白质分析
低流速液相色谱法	低流速液相色谱法涵盖纳升级、微升级和毛细管级流速范围，从低纳升/分钟到约50微升/分钟。由于柱内径减小，样品带稀释减少，因此该技术提高了灵敏度。	非常适合在复杂生物基质中对分子进行高灵敏度测量，其中分析物浓度可能跨越几个数量级
制备型液相色谱	制备型液相色谱技术包括收集分馏后的洗脱液将其收集到独立的样品容器中，以分离一种或多种分析物，从而纯化主要成分或分离杂质以便进一步研究	各种应用，如药物的大规模纯化，或小规模用于提高产品产率或分离纯净化合物

多通道液相色谱系统

多通道液相色谱系统采用多个流路，帮助色谱分析人员进行复杂和/或并行的分离过程。多通道系统的优势包括更高的样品处理量、更好地解析复杂样品，以及增强分析物定量能力

多通道液相色谱技术	工作原理	应用
二维液相色谱	2D-LC 是一种先进的分离技术，通过两种互补的色谱柱化学性质，实现多维分离，而不是仅通过单一色谱柱对样品进行分离。	二维液相色谱可应用于复杂化学混合物，如疫苗和食品中存在干扰基质的样品。
双液相色谱	Dual LC（双LC） 是一种多通道高效液相色谱方法，在单一系统中使用两个独立流路，可同时进行两项分析。	适用于需要提高样品通量的情况，例如在一次运行中同时分析样品中的农药和酚类，或同步进行重复分析。
串联液相色谱	Tandem LC 这些技术使用第二个泵和智能柱切换，通过减少柱子再生的停机时间来最大化检测器的使用率。	最适用于药物发现实验室的先导化合物筛选，以提高样品通量并最大化检测器利用率。

想了解更多关于HPLC分析的信息吗？

看到液相色谱的发展令人难以置信。液相色谱在现实时间中。从一开始分离色素，到基础的液相色谱，这曾是一个非常手动且耗时数小时才能分离目标化合物的过程。如今，借助现代HPLC和UHPLC仪器，分离过程只需几分钟，甚至在某些情况下只需几秒钟。

此外，通过结合紫外检测（UV）、质谱（MS）以及带电气溶胶检测器（CAD）等多种检测技术，对化合物进行检测、鉴定与定量分析变得前所未有地高效与便捷。

• 观看：赛默飞高效液相色谱（HPLC）的进化之旅。
• 访问我们的学习中心了解更多关于高效液相色谱的信息，并获取我们的虚拟HPLC仪器产品导览。
• 别忘了关注我们的LinkedIn上的色谱与质谱页面。