限制性内切酶入门：从基础知识到 Golden Gate 克隆

限制性核酸内切酶几十年来一直是分子生物学中的基础工具，通常被认为是简单的DNA切割工具。然而，这些“分子剪刀”比表面上看起来要复杂和有趣得多。

什么是限制性核酸内切酶？

限制性核酸内切酶，也被称为限制酶，是一类由细菌和一些古菌产生的特殊蛋白质，能够在特定序列（称为限制位点）上切割（通常是双链）DNA。

限制位点通常是短的回文序列，长度为四到八个碱基对。在这些识别位点上的甲基化可以防止宿主DNA自身被消化，使其对自身的限制性核酸内切酶切割具有抗性。

由限制酶产生的DNA片段可以具有粘性末端或平末端，这取决于酶如何切割DNA链。

• 粘性末端这些是由限制性酶在DNA上产生错位切割时形成的单链突出端。这些突出端位于5′或3′末端，可以与其他DNA片段上的互补序列形成氢键。由于这种特性，粘性末端在分子克隆中尤为有用，因为它们通过碱基配对促进DNA片段的精确高效连接，随后再由DNA连接酶封闭。
  
• 平末端这些是在限制性酶直接切割两条DNA链时产生的，结果是没有突出端的片段。由于平末端缺乏互补突出端，在连接过程中效率低于粘性末端。然而，它们具有通用兼容性的优势，即任何两个平末端片段都可以连接在一起，而不受其序列影响。

目前已知有超过4,000种限制性酶，针对400多个识别序列。

关于限制性核酸内切酶发展的里程碑事件，请参阅限制性核酸内切酶基础知识。

主要类型的限制性核酸内切酶

根据结构复杂度、识别位点、切割位点和辅因子需求，限制性核酸内切酶分为四大类或类型。

酶类别	特征
I型	– 多亚基蛋白，具有限制和甲基化双重活性 – 需要SAM、ATP和Mg2+需求条件 – 切割位点距离识别位点有可变距离
II型	– 具有特异性识别序列，切割位点在识别序列内或附近 – 在切割位点产生5′磷酸和3′羟基末端 – Mg2+大多数的要求
III型	– 两部分识别序列呈反向排列 – 切割位点距离其中一个识别序列有特定距离 – 需要ATP
IV型	– 只切割甲基化DNA – 切割位点距离识别位点约30个碱基对

II型限制性酶是分子生物学中最常用的，因为它们能够在其识别序列内或附近的特定位点切割DNA，而无需ATP。

IIS型限制性内切酶在其作用机制上具有独特性。与识别回文序列并在其识别位点内或紧邻处切割DNA的IIP型酶不同，IIS型酶识别非回文DNA序列，并在距离该序列一定距离的位置进行切割。这一独特性质在Golden Gate组装中非常有用，因为可以生成带有自定义长度和序列的粘性末端的DNA片段，从而实现精确且无缝地连接。

限制性核酸内切酶的切割位点

同工限制酶是来自不同生物但具有相同限制位点并在相同位置切割DNA的限制性内切酶。例如，一对限制性内切酶SpeI 和BcuI 都能识别序列 5′-A↓CTAGT-3′ 并在相同位置进行切割，因此这两种酶可以互换使用。

新同工限制酶是同工限制酶的一类，它们能够识别相同的序列，但会在不同的位置切割DNA，从而产生多样化的末端。限制性内切酶SmaI 和Xma我识别序列5′-CCCGGG-3′，但是SmaI在限制性位点的正中间（5′-CCC↓GGG-3′）切割，产生平端，且XmaI在5′-C↓CCGGG-3′处切割，产生粘性末端。

同工酶为实验设计提供了多种优势：

1. 性能提升新发现并商业化的同裂酶相比传统酶更具成本效益，并且拥有更优越的特性，例如更高的稳定性和无星活性。
2. 甲基化敏感性有些同裂酶对DNA甲基化敏感，而另一些则不敏感。这一特性对于研究表观遗传修饰尤为有用。

如需了解更多信息，请访问我们的甲基化DNA消化页面

当你看到类似上述的酶名称时，BcuI（SpeI），括号中列出的酶，Spe我，代表一种原型
——即第一个被发现和鉴定的限制性内切酶。BcuI 是在原型之后发现的同工异构酶。SpeI 能识别并切割相同的 DNA 序列。

使用IIS型限制性核酸内切酶：Golden Gate克隆技术

Golden Gate 组装，也称为 Golden Gate 克隆，是一种利用 IIS 型限制性内切酶独特性质的方法。在该技术中最常用的酶包括：Eco31I (BsaI)，BpiI（BbsI)，以及Esp3I（BsmBI）。

由于识别位点和切割位点是分开的，DNA会在距离识别位点一定的位置被切割，而不是在序列本身内部，因此产生的粘性末端在不同的切割位点之间会有所不同。这使得可以灵活设计包含多个插入片段的构建体。

在Golden Gate组装中，插入片段和目的载体都含有兼容的切割位点，这些位点能够生成互补的粘性末端，从而使各个片段按照预期顺序进行组装。

识别位点在目的载体中被定位于外侧（即插入区域内，而非载体骨架），而在插入片段中则定位于内侧（即朝向待组装DNA），确保这些识别位点不会保留在最终构建体中。这允许所有插入片段和目的载体同时用限制性酶和DNA连接酶进行单次反应处理。如果插入片段未被组装到目的载体中，识别位点将会保留，使限制性酶将载体线性化。由于线性化的载体在细菌转化中的效率较低，可以最大程度减少转化背景。Golden Gate克隆技术最多可组装35个DNA片段^[1].

无缝Golden Gate组装技巧

• 在实验开始前，使用SnapGene或Benchling等软件工具可视化并确认插入片段与目的载体中识别位点的方向。确保识别位点在目的载体中朝外，在插入片段中朝内。如果方向正确，消化后识别位点将在载体和插入片段上都被去除。
• 分析你的插入片段和目的载体序列，确保没有其他可能干扰克隆过程的额外识别位点。
• 最多可将10个片段组装到一个构建体中。
• 优化你的实验条件。确保你的连接缓冲液含有ATP。

应用：植物工程中的Golden Gate克隆技术

由于合成生物学的进步，植物研究和育种工作通过使用序列特异性核酸酶（如TALENs、ZFNs和CRISPR–Cas系统）得到了显著提升。^[2]

植物基因工程研究通常涉及设计复杂的合成构建体，例如新的代谢途径、基因调控盒或用于基因组编辑的构建体。^[3,4] 例如，用于基因工程的盒通常包含多个插入片段，这些片段编码一个或多个向导RNA以及所需的核酸酶。

合成途径构建需要对许多调控元件进行合理设计，以建立遗传逻辑门。在这种情况下，Golden Gate组装是一种有吸引力的工具，它通过允许在单次反应中同时组装多个DNA片段并减少大量筛选需求，简化了克隆过程，从而推动农业和生物技术领域的创新。^[5]

关于限制性核酸内切酶的更多资源

• 英维创分子生物学学院：限制性酶教育
• 选择工具：常规限制性酶选择工具 & FastDigest限制性酶选择工具
• 计算器：双重消化计算器
• 目录：限制性酶

参考文献

1. Pryor, J. M., Potapov, V., Kucera, R. B., Bilotti, K., Cantor, E. J., & Lohman, G. J. S. (2020). Enabling one-pot Golden Gate assemblies of unprecedented complexity using data-optimized assembly design. PloS one, 15(9), e0238592. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238592
2. Osakabe, Y., & Osakabe, K. (2015). Genome editing with engineered nucleases in plants. Plant & cell physiology, 56(3), 389–400. https://doi.org/10.1093/pcp/pcu170
3. Van Eck J. (2020). Applying gene editing to tailor precise genetic modifications in plants. The Journal of biological chemistry, 295(38), 13267–13276. https://doi.org/10.1074/jbc.REV120.010850
4. Pan, C., Wu, X., Markel, K., Malzahn, A. A., Kundagrami, N., Sretenovic, S., Zhang, Y., Cheng, Y., Shih, P. M., & Qi, Y. (2021). CRISPR-Act3.0 for highly efficient multiplexed gene activation in plants. Nature plants, 7(7), 942–953. https://doi.org/10.1038/s41477-021-00953-7
5. Karimi, M., & Jacobs, T. B. (2021). GoldenGateway: A DNA Assembly Method for Plant Biotechnology. Trends in plant science, 26(1), 95–96. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2020.10.004
6. Hahn, F., Korolev, A., Sanjurjo Loures, L., & Nekrasov, V. (2020). A modular cloning toolkit for genome editing in plants. BMC plant biology, 20(1), 179. https://doi.org/10.1186/s12870-020-02388-2

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