Activación y disociación iónica basada en colisiones

Por Amanda Lee, directora de marketing de productos

Introducida hace casi 80 años, la activación y disociación iónica basada en colisiones es el tipo de fragmentación más utilizado en la actualidad en el mercado. En principio, esta técnica es bastante sencilla: se aplica energía para acelerar las partículas de interés hasta que colisionan con un gas inerte para inducir la fragmentación. Dentro de estos parámetros, existen muchas subcategorías diferentes de la técnica. A continuación, analizaremos tres técnicas basadas en colisiones que se producen en los espectrómetros de masas Thermo Scientific.

Disociación por colisión de alta energía (HCD)

1. Proceso: La HCD es una técnica basada en haces que se produce en la célula HCD o en el multipolo de enrutamiento de iones, donde el haz de iones se dirige hacia un pozo de potencial. Las moléculas excitadas colisionan con el gas de colisión, provocando la fragmentación. Este gas suele ser nitrógeno y es rápido y eficiente, pero indiscriminado en cuanto a la técnica. Para garantizar una colisión de mayor energía, la energía potencial se reduce (normalmente desde el cuadrupolo hasta la celda de colisión) en varias decenas de eV. Esto garantiza que los iones tengan una alta energía al entrar en la celda con nitrógeno y colisionen con la energía suficiente para que se produzca la fragmentación. En péptidos y proteínas, la HCD favorece la formación de iones b e y. [Figura 1]
2. Aplicaciones: La HCD se utiliza comúnmente para la proteómica y la metabolómica en general.
3. Consideraciones: Cuando utilizamos espectrómetros de masas Thermo Scientific para la fragmentación HCD, generalmente utilizamos la energía de colisión normalizada (NCE) en lugar de introducir directamente los eV de «caída» del pozo de potencial. La rutina de calibración determina el voltaje óptimo para una serie de iones en la solución de calibración. A continuación, la rutina escala estos voltajes absolutos a un valor de «energía de colisión normalizada» de 30. Por lo tanto, un valor de NCE de 30 debería funcionar bien en un rango de valores de m/z y estados de carga. Para ver el valor real aplicado, se puede consultar fácilmente el encabezado del escaneo del espectro en nuestro software Thermo Scientific Freestyle.

Figura 1: Ubicación de la escisión de la cadena principal del péptido/proteína y su nomenclatura. Aquí se muestra un péptido de 4 aminoácidos con cadenas laterales etiquetadas como R1-4.

Dissociation Induced Collision (CID) (versión específica para trampas de iones)

1. Proceso: La CID, tal y como se produce en la tecnología de trampa de iones lineal dual de Thermo Fisher Scientific, es una técnica basada en la resonancia en la que las moléculas se excitan mediante una frecuencia específica. Estas moléculas excitadas comienzan a chocar contra moléculas de He a una velocidad mayor. Estas colisiones calientan lentamente las moléculas resonantes hasta que se fragmentan. Una vez que se produce la fragmentación, los iones producto con nuevos valores de m/z dejan de ser excitados por la frecuencia y se enfrían hasta volver al centro de la trampa. En péptidos y proteínas, la CID favorece la formación de iones b e y.
2. Aplicaciones: La CID es ideal para moléculas pequeñas y péptidos y ayuda a fragmentar oligonucleótidos, especialmente cuando se ajusta el valor q. También fragmenta con mayor eficiencia, lo que la hace muy adecuada para MS3 y flujos de trabajo superiores.
3. Consideraciones: Dado que la CID se basa en la resonancia, existe una compensación descrita en la ecuación de Matthieu. Con determinados voltajes y frecuencias aplicados, solo se pueden atrapar determinados valores m/z. Por lo tanto, existe lo que se conoce como la regla del tercio. Esta regla aproxima la ecuación y establece que cualquier fragmento creado que sea inferior a 1/3 del m/z del precursor no será atrapado. Esta regla hace que la CID sea menos deseable como técnica de fragmentación primaria, por lo que se utiliza más como sustituta cuando se necesita una fragmentación alternativa después de que la HCD haya demostrado ser ineficaz para una molécula específica. Además, la CID es un proceso de calentamiento lento. Como tal, la activación/fragmentación tarda unos milisegundos, mientras que la HCD es prácticamente instantánea.

Los recientes avances en el análisis de oligonucleótidos han demostrado grandes avances en el uso de la CID para la fragmentación de muchos tipos, incluyendo el ARNt, el ARNsn y el ARNm digerido. Para obtener el máximo rendimiento de estos experimentos, los científicos pueden ajustar el valor q aplicado dentro de la resonancia CID. Normalmente, se establece en 0,25; sin embargo, en el caso de los oligonucleótidos, reducir ese valor a 0,2-0,15 puede ayudar a evitar que se produzca una fragmentación no deseada y especificar la escisión de la cadena principal, que puede caracterizarse más fácilmente.

Dissociation Induced by Source (SID)

Proceso: La SID es una técnica de activación (y, si se desea, disociación) inducida por colisión que se induce en la región de la fuente de los espectrómetros de masas. Al aplicar más voltaje en la región de la fuente, los iones son atraídos hacia el espectrómetro de masas con más energía. Dentro de la región de la fuente, todavía hay gases inertes atmosféricos que han sido atraídos junto con los analitos de interés.

• Con la energía adicional, pueden producirse colisiones con estos gases inertes. Dado que la SID se produce antes de cualquier analizador de masas, se aplica a todos los iones que entran en el espectrómetro de masas.
• Aplicaciones: La SID se utiliza más comúnmente como técnica de desolvación para moléculas nativas de gran tamaño. Al aplicar energía SID en la fuente, las moléculas generan energía vibratoria y solo se rompen los enlaces no covalentes y de baja energía.
• Analogía: La SID podría compararse con sacudir un paraguas después de entrar de la lluvia. El movimiento no hace que todo el paraguas se desmorone, pero sí hace que caigan las gotas de agua. Esto es un poco como las proteínas que se desolvatan con la SID.
• Consideraciones: La SID también puede ser un proceso destructivo y disociativo, por lo que, si ese no es el objetivo, es importante controlar la energía aplicada al analito. Por ejemplo, en la proteómica descendente es habitual utilizar un ajuste pequeño (10-15 eV) para el SID con el fin de facilitar la desolvatación. Sin embargo, he conseguido tomar proteína pura (o proteína bien separada cromatográficamente) y aplicar un SID mucho más alto (>50 V) para inducir la disociación. El patrón de fragmentación resultante puede dar resultados sorprendentemente buenos. Sin embargo, no es una práctica habitual, especialmente en el caso de especies coeluyentes, ya que la fragmentación se produciría en todas las proteínas eluidas.

Otra consideración para la SID es su uso en MS nativa. A menudo es vital para una buena detección de proteínas nativas como los anticuerpos. A menudo, en estos casos empleamos una SID más fuerte, entre 60 y 120 V, dependiendo del tamaño y la complejidad de la proteína o el complejo proteico, para garantizar una desolvatación adecuada y, por lo tanto, la detección.

Más información sobre la dissociación inducida por colisión (CID) y la disociación inducida por colisión de alta energía (HCD)