1. ¿Qué es la fragmentación en el contexto de la espectrometría de masas?
La fragmentación, en este sentido, es el proceso de dividir una molécula en partes más pequeñas dentro de un espectrómetro de masas. Al aplicar energía para romper los enlaces, creamos fragmentos que proporcionan pistas fundamentales sobre la estructura de la molécula, lo que ayuda a los científicos a reconstruir la imagen completa de una sustancia desconocida.
Estos fragmentos forman un espectro, una huella digital única de la molécula, que ayuda a identificar sus componentes, modificaciones y estructura general.
2. ¿Por qué es importante la fragmentación?
Sin fragmentación, solo se conocería la masa intacta de una molécula. Esto puede proporcionar cierta información, pero para identificar algo tan complejo como un péptido, sería difícil conocer la secuencia exacta de aminoácidos.
En una búsqueda estándar de péptidos trípticos, utilizando una biblioteca HeLa, hay hasta 20 péptidos que se superponen dentro de cada bin de error de 10 ppm. (FIGURA 1) La fragmentación se vuelve esencial para obtener la información completa, ya que los péptidos dentro de un error de masa razonable pueden eluirse al mismo tiempo o tener una elución menos predecible, por lo que la coincidencia mediante MS1 solo arroja demasiados resultados.
Esto ni siquiera tiene en cuenta la adición de modificaciones en el espacio de búsqueda. Solo para contextualizar, hay un gran número de péptidos putativos con modificaciones1 (Figura 2), muchos de los cuales se beneficiarían del uso de técnicas de fragmentación alternativas para ayudar a identificarlos y caracterizarlos. Discutiremos muchos de ellos con más detalle en otras secciones. Sin fragmentación, no habría forma de distinguir muchos péptidos entre sí para realizar una identificación con confianza.
Piense en un péptido como una radio. La masa intacta es la carcasa: le dice que es una radio, pero no le muestra cómo funciona ni qué hay dentro. Sin desmontar la radio, podría poner la misma carcasa en un pastel y pensar que tiene dos radios idénticas. Para entenderla realmente y construir una réplica, hay que desmontar pieza por pieza. Eso es exactamente lo que hace la fragmentación en la espectrometría de masas.
Figura 1: Biblioteca HeLa de péptidos digeridos con tripsina clasificados por errores de 10 ppm. Aquí se destaca el rango de 500-550 m/z, que muestra contenedores individuales con hasta 20 posibles coincidencias de secuencias de péptidos.
Figura 2: Modificaciones postraduccionales putativas (PTM) de la base de datos Swiss-Prot, enumeradas en orden descendente.1
3. ¿Qué aplicaciones dependen de tipos de fragmentación alternativos o múltiples?
La fragmentación es un aspecto bien establecido de la espectrometría de masas, pero algunos sistemas ofrecen muchas opciones de fragmentación, mientras que otros solo tienen una o incluso ninguna. La necesidad en este ámbito depende totalmente de la aplicación que se esté estudiando.
La mayoría de los experimentos de proteómica obtienen fragmentos ricos y significativos a partir de métodos rápidos, eficientes y comunes basados en colisiones. Por otro lado, las muestras proteómicas ricas en glicosilación se rompen con demasiada facilidad, lo que destruye la capacidad de mapear la modificación, por lo que es necesario emplear técnicas más suaves, como las basadas en electrones.
En términos generales, cuando los científicos necesitan una mejor caracterización de su analito, recurren a técnicas de fragmentación múltiples o alternativas para lograrlo. La glicómica, la glicoproteómica, la lipidómica, la proteómica descendente y la metabolómica suelen basarse en la fragmentación alternativa o complementaria para la caracterización completa de las moléculas.
Una de las aplicaciones más usuales de la fragmentación es en proteínas y péptidos. Se fragmentan de forma predecible a lo largo de su cadena principal para crear iones fragmentados a, b, c o x, y, z. [Figura 3]. Los fragmentos de tipo A, B y Cson aquellos que incluyen desde el extremo N-terminal del péptido hasta el número de residuos de aminoácidos, leyendo de izquierda a derecha. Los fragmentos de tipo X, Y y Z son aquellos que incluyen desde el extremo C-terminal del péptido hasta el número de residuos de aminoácidos, leyendo de derecha a izquierda.
Figura 3: Ubicación de la escisión de la cadena principal del péptido/proteína y su nomenclatura. Aquí se muestra un péptido de 4 aminoácidos con cadenas laterales etiquetadas como R1-4.
En esta serie, cubriremos los conceptos básicos, los principios, las aplicaciones y las consideraciones de las técnicas alternativas de fragmentación y manipulación de iones disponibles en los espectrómetros de masas de Thermo Scientific. A continuación, la fragmentación basada en colisiones.
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