Análisis de Microvolúmenes desde Principios del siglo XXI

Por Patrick Brown

En los antiguos tiempos de la ciencia, conocidos como los años 90, los investigadores que deseaban analizar y cuantificar ácidos nucleicos o proteínas se veían relegados a prácticas laboriosas que requerían mucho tiempo. Realizar mediciones UV-Vis de soluciones de ADN o ARN requería múltiples pasos únicamente para preparar las muestras para el análisis. Las muestras muy concentradas debían diluirse para obtener mediciones precisas; estas diluciones implicaban múltiples pasos manuales como añadir cantidades medidas con precisión de agua y/o solución tampón, y cada paso daba lugar a la posibilidad de cometer un error. Con tantos pasos individuales, la generación de datos precisos también era un reto en estos primeros días antes del cambio del siglo XXI.

Tradicionalmente, estas mediciones de cuantificación se realizaban en un espectrofotómetro ultravioleta-visible (UV-Vis). Aprovechando los compuestos aromáticos intrínsecos en las bases de los ácidos nucleicos o los residuos de aminoácidos de las proteínas, los espectrofotómetros UV-Vis son capaces de medir la absorbancia de longitudes de onda específicas de la luz por dichos compuestos y generar así información sobre las cantidades de las sustancias de interés. Estos instrumentos suelen utilizar una cubeta de 1 cm de ancho para contener un volumen de 3 a 4 mL de una muestra. Aunque este método de análisis es completamente viable y todavía se utiliza en algunos lugares hoy en día, dista mucho de ser ideal. El deseo de evitar las laboriosas diluciones de las muestras y de simplificar el flujo de trabajo condujo, como suele ocurrir, a la investigación y el desarrollo de nuevas tecnologías.

En 2001 se lanzó un instrumento revolucionario: el espectrofotómetro de microvolúmenes. El instrumento original podía efectuar un análisis cuantitativo preciso de biomoléculas utilizando un solo microlitro de muestra. La técnica funcionaba porque la longitud del trayecto podía ajustarse para garantizar que los valores de absorbancia se mantuvieran dentro de los límites de detección del instrumento. De este modo se evitaban las diluciones, que requerían mucho tiempo, y se reducían las posibilidades de cometer errores en la preparación de las muestras.

El espectrofotómetro de microvolumen ganó fácilmente acólitos y su adopción por los laboratorios se extendió rápidamente. ¿Por qué no iba a ser así? Al efectuar los análisis de las muestras con mayor rapidez y sin necesidad de diluciones, el instrumento ofrecía a los investigadores la posibilidad de realizar más tareas con mayor precisión. Los desarrollos posteriores siguieron mejorando y ampliando las ideas desarrolladas por primera vez en 2001.

Los principios utilizados a principios del siglo XXI para cuantificar el ácido nucleico no han cambiado, como tampoco lo ha hecho el flujo de trabajo: una vez que un cliente pipetea 1-2 microlitros de su muestra en un pedestal metálico dentro de un instrumento, se baja otro pedestal del instrumento, que toca la muestra y crea un puente de tensión superficial. Al iluminar la muestra y compararla con un “blanco”, puede calcularse la absorbancia.

En 2008, se introdujo un analizador multimuestra, capaz de evaluar hasta 8 muestras múltiples simultáneamente. Esto ofrecía un mayor rendimiento que todo lo anterior. El instrumento concreto con esta capacidad ampliada permitió a los investigadores procesar y analizar de forma eficiente y precisa hasta ocho muestras de proteínas y ácidos nucleicos a la vez.

Antes de que se desarrollara un software más sofisticado, los usuarios tenían que comparar manualmente dos ratios de pureza diferentes de una muestra con unas directrices establecidas para deducir la pureza de su muestra de ácido nucleico. Con la llegada de algoritmos matemáticos avanzados (es decir, programación de software), los investigadores tuvieron la posibilidad de ir más allá de la simple evaluación de la pureza para identificar realmente qué contaminante podría estar presente en una muestra. Se desarrolló un software avanzado que podía proporcionar cuatro ventajas importantes: 1) podía identificar burbujas en una muestra que pudieran afectar negativamente a las lecturas; 2) el software podía reconocer cuándo la columna de líquido dejaba de estar en contacto con el pedestal superior del instrumento; 3) proporcionaba asistencia técnica a bordo y guiaba en la resolución de problemas; y 4) no sólo identificaba, sino que corregía la presencia de un contaminante. Estos avances proporcionaron a los clientes más conocimientos sobre la composición de sus muestras, lo que les permitió tener más éxito en los experimentos posteriores.

Cumplimiento de las directrices

El software, tal y como existe hoy en día, tiene la capacidad de adherirse a un conjunto de directrices que ayudan a garantizar la reproducibilidad y/o las normativas de seguridad de datos como la 21 CFR Parte 11. Algunos usuarios exigen que su investigación cumpla estas directrices, que codifican los criterios que los investigadores deben proporcionar al publicar los datos, para demostrar que su investigación es precisa y reproducible. Que el software pueda hacer esto ahorra mucho tiempo y esfuerzo a los investigadores, y da confianza en que los resultados cumplen la normativa.

La capacidad de identificar y corregir impurezas mediante quimiometría es una de las mejoras más importantes a lo largo de las dos décadas de desarrollo continuo del análisis de microvolúmenes. Además, la mejora de las capacidades del software ha contribuido a impulsar la evolución de la capacidad de los espectrofotómetros de microvolumen para medir muestras de proteínas sin diluir y proporcionar datos conformes con la normativa. A partir de 2020, los algoritmos de software incorporarán incluso la capacidad de diferenciar el ADN de mamífero del ARN de mamífero. Avances como este seguramente conducirán a desarrollos aún más beneficiosos en el futuro.

Puede resultar difícil seguir la pista de todos estos avances históricos a lo largo de los años, pero no se preocupe: todo está disponible en una útil infografía.

La popularidad del análisis avanzado de microvolúmenes es evidente, y los espectrofotómetros de microvolúmenes se utilizan en el mundo académico y en múltiples industrias.

¿Qué nos depara el futuro? Nadie lo sabe con certeza, pero si el objetivo es facilitar la vida de los científicos, acelerar su investigación y permitir a los usuarios publicar artículos científicos, el análisis de microvolúmenes rápido, eficiente y fiable formará parte de ello.

Recursos adicionales

• https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/manuals/ts-nanodrop-nucleicacid-olv-r2.pdf
• https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/Product-Bulletins/acclaro-protein-contaminent-id-detection-nucleic-acid-samples-TN52853.pdf
• https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Application-Notes/AN53374-nanodrop-uv-vis-detects-rna-contaminmation-dna.pdf
• https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/Reference-Materials/celebrating-100k-nanodrop-infographic-ig1049-en.pdf 

Nota del editor: Este mes, el Thermo Scientific™ Nanodrop™ Spectrophotometer, el primer espectrofotómetro de microvolumen para realizar un análisis cuantitativo preciso de biomoléculas utilizando un solo microlitro de muestra, celebra más de 100.000 unidades construidas y utilizadas en todo el mundo académico y en múltiples industrias desde su introducción en 2001.