フラグメント解析～がん研究を促進する汎用的な解析方法～

がんは、半世紀以上にわたって研究されてきましたが、未だ克服されていない病気です。一方で、ゲノムの変化と腫瘍形成の関係の理解は深まりました。ゲノム解析技術は、がん発症メカニズムの解明、がん細胞の検出、がん治療法の研究に役立ちます。Applied Biosystems™ブランドは、最前線でこのような技術を開発し、がん研究に利用可能な多くの技術を持っています。

キャピラリー電気泳動（CE）によるフラグメント長の解析

フラグメント解析は、サイズが異なる蛍光標識DNA断片をCEで分離する、非常に汎用性の高い方法です。解析用のDNA断片を生成する最も一般的な方法のひとつに、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）があります。PCRは、プライマーの選択に柔軟性があるため、目的の配列に対応する任意のサイズの断片を簡単に生成できます。また、DNA断片を標識する蛍光色素は最大4種類あり、高い自由度で実験をデザインすることができます。ジェネティックアナライザによるフラグメント解析は、さまざまな種類のがんの遺伝子異常を研究するために利用されています。

マイクロサテライト不安定性の検出

大腸がん、胃がん、子宮体がんなど、いくつかの腫瘍では、DNAミスマッチ修復（mismatch repair：MMR）酵素の異常に起因する、ゲノムの不安定性がみられます ⁽¹⁾。ゲノムの不安定性は、ゲノム上に散在する短い反復配列（マイクロサテライト配列）の長さの変化を解析することで検出できます。この方法は、マイクロサテライト不安定性（MSI）解析として知られており、通常、マイクロサテライト配列の断片長の変化を解析します。
MSI解析は、目的のマイクロサテライト領域に対するプライマーセットをデザインしたり^（2）、MSI解析用に最適化されたキットを使用することで行われてきました^（3,4）。NGSによるMSI解析も可能ですが、高度に反復した配列を読んでアライメントするのは難しく、最近の研究結果では、ゲノム参照配列にアライメントすると望ましくないバイアスが生じることが示唆されています⁽⁵⁾。 フラグメント解析の結果は参照配列にアライメントする必要がないため、比較的明確なMSI解析方法です。

特定遺伝子におけるリピート長の変化の解析

マイクロサテライト以外でもリピート長の変化を示すことがあり、そのいくつかは腫瘍形成に関係しています。その中で最もよく研究されているのが、造血に関与するFMS様チロシンキナーゼ３（FMS-like tyrosine kinase 3：FLT3）遺伝子です。急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia：AML）におけるFLT3の遺伝子内縦列重複（internal tandem duplication：ITD）変異はよく報告されており、フラグメント解析によって検出できます^(6-9)。ITDのフラグメント解析は、SNPのような特定のタイプの変異を検出することはできませんが、FLT3遺伝子の変異解析のための重要な方法であることが示されています⁽¹⁰⁾。
フラグメント解析によるリピート長解析のもうひとつの例として、アンドロゲン受容体（androgen receptor：AR）遺伝子のCAGリピートに関する研究を紹介します。CAGリピートの伸長は、神経変性疾患である球脊髄性筋萎縮症（spinobulbar muscular atrophy：SBMA）に関与することが知られています。また、疫学調査から、精巣腫瘍の発症は性ステロイドホルモンとその受容体の作用の不均衡によることが示唆されています。CAGリピート長の変化はアンドロゲン受容体の発現レベルを変化させる可能性があることから、Grassettiらは、フラグメント解析を用いて、精巣腫瘍サンプルにおけるリピート長と病態との相関を調べました⁽¹¹⁾。

がん原遺伝子における病原性変異の検出

腫瘍でよく見られる変異には、コード領域内での短い挿入・欠失（indel）もあります。このような変異は配列長を変化させるため、フラグメント解析で検出することができます。例えば、さまざまな腫瘍におけるEGFR遺伝子のExon 19の欠失は、フラグメント解析によってスクリーニングされています^(12,13)。同様に、カルレティキュリン（calreticulin：CALR）遺伝子のindelもフラグメント解析でスクリーニングされています^(14-16)。フラグメント解析の汎用性は、BRCA1^(17,18)、NPM1⁽¹⁹⁾、GATA1⁽²⁰⁾、CCR4⁽²¹⁾、NOTCH1⁽²²⁾におけるindelの検出によっても示されています。Calvacanteらは、胃がんと大腸がんに関連する12種類の遺伝子のindelを、フラグメント解析により調べました⁽²³⁾。これらの研究例は、フラグメント解析が、病原性に関連するindelをスクリーニングするための重要なツールになりうることを示しています。

ゲノム中の再構成の解析

PCRプライマーを注意深く選択することで、フラグメント解析は、腫瘍サンプル中の大きな遺伝子再構成の検出にも使用できます。例えば、T細胞性急性リンパ性白血病と診断された韓国人の、T細胞受容体のクローン性の解析に、フラグメント解析が用いられました⁽²⁴⁾。また、Shettyらは、滑膜肉腫における染色体転座を検出するためのフラグメント解析アッセイをデザインしました⁽²⁵⁾。彼らの研究では、フラグメント解析は、RT-PCRよりも高い感度で融合転写産物を検出できることが示されています。

フラグメント解析の新しい手法と解析

フラグメント解析の新たな利用法を開発する研究者たちによって、この解析方法の汎用性は広げられ続けています。Friedrichらの研究により、フラグメント解析とNGS技術の補完性が示されました⁽²⁶⁾。彼らは、NGSでは見逃される可能性のある、血液腫瘍のASXL-1遺伝子における複数の変異を検出するためのアッセイを開発しました。フラグメント解析は、化学療法剤によるDNA損傷の解析^(27,28)、膵臓がんにおけるBRCA1遺伝子とRAD51C遺伝子のDNAメチル化の解析⁽²⁹⁾にも利用されています。また、遺伝子発現パターンに基づき、急性リンパ芽球性白血病のサブタイプを分類するために、新しいマルチプレックスな手法も開発されました^(30,31)。

まとめ

フラグメント解析の利点のひとつは、その汎用性です。PCRプライマーとPCR条件を適切に選択することで、あらゆるゲノムの異常を調べることができます。本ブログでは、腫瘍細胞における遺伝子の機能および機能不全を理解するために、フラグメント解析が活用されている例を紹介しました。

【無料ダウンロード】がん研究を促進させる遺伝子解析技術ハンドブック

ダウンロードはこちら

しかし、紹介した例が全てではありません。フラグメント解析の汎用性の高さは、研究者の想像力と創造力にかかっています。
フラグメント解析は、腫瘍学、感染症、希少遺伝性疾患、神経科学など、多くの分野で利用されています。サンガーシーケンスや次世代シーケンス（NGS）などの技術も使用されていますが、フラグメント解析は、キャピラリー電気泳動の精度と、簡素化されたワークフロー、および、マルチプレックス機能を兼ね備えています。

フラグメント解析のユーザーガイド

ダウンロードはこちら

このガイドには、フラグメント解析技術の原理、キャピラリー電気泳動の基礎、さまざまなワークフローのステップ、必要な試薬、および、よく使用されるいくつかのアプリケーションのための方法などが記載されています。

参考文献

1. Chang L et al. Microsatellite Instability: A predictive biomarker for cancer immunotherapy. Appl Immunohistochem Mol Morphol 26:e15-e21 (2018). https://org/10.1097/PAI.0000000000000575
2. Shubin V. et al. Microsatellite instability in Russian patients with colorectal cancer. Int J Mol Sci 23:7062 (2022). https://doi.org/10.3390/ijms23137062
3. https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/global/forms/truemark-pricing-application-note-form.html
4. Contos G. et al. Assessment of immune biomarkers and establishing a triple negative phenotype in gynecologic cancers. Gynecologic Oncology 163:312-319 (2021). https://doi.org/10.1016/j.ygyno.2021.09.011
5. Saul M. et al. Population bias in somatic measurement of microsatellite instability status. Cancer Medicine 9:6452-6460 (2020). https://doi.org/10.1002/cam4.3294
6. Döhner H et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood 129(4):424-447 (2017) https://org/10.1182/blood-2016-08-733196
7. Lagunas-Rangel FA and Chávez-Valencia V. FLT3-ITD and its current role in acute myeloid leukaemia. Med Oncol. 34(6):114 (2017). doi: 10.1007/s12032-017-0970-x.
8. Kim Y et al. Quantitative fragment analysis of FLT3-ITD efficiently identifying poor prognostic group with high mutant allele burden or long ITD length. Blood Cancer Journal 5:e336 (2015) https://doi.org/10.1038/bcj.2015.61
9. Engen C. et al. FLT3-ITD mutations in acute myeloid leukaemia – molecular characteristics, distribution and numerical variation. Molecular Oncology 15:2300-2317 (2021) https://org/10.1002/1878-0261.12961
10. Cumbo C. et al. FLT3 mutational analysis in acute myeloid leukemia: advantages and pitfalls with different approaches. Blood Reviews 54:100928 (2022). https://doi.org/10.1016/j.blre.2022.100928
11. Grassetti D. et al. Androgen receptor polymorphisms and testicular cancer risk. Andrology 3:27-33 (2015). https://doi.org/10.1111/j.2047-2927.2014.00252.x
12. Rennert et al. Long term follow-up of EGFR mutated NSCLC clones. Translational Oncology 14:100934 (2021). https://doi.org/10.1016/j.tranon.2020.100934
13. Forsythe M. et al. Molecular profiling of non-small cell lung cancer. PLoS One (2020) https://doi.org/10.1371/journal.pone.0236580
14. Grinsztejn E. et al. The prevalence of CALR mutations in a cohort of patients with myeloproliferative neoplasms. Int J Lab Hematol 38:102-106 (2015) https://doi.org/10.1111/ijlh.12447
15. Gardner J-A. et al. Detection of CALR mutation in clonal and non-clonal hematologic diseases using fragment analysis and next generation sequencing. Am J Clin Pathol 146:448-455 (2016) https://doi.org/10.1093/AJCP/AQW129
16. Chi J et al. Calreticulin mutations in myeloproliferative neoplasms and a new methodology for their detection and monitoring. Ann Hematol 94:399-408 (2015) https://doi.org/10.1007/s00277-014-2232-8
17. Yang C. et al. Characterization of a novel BRCA1 splice variant, c5332+4delA. Breast Cancer Res Treat 168(2) 543-550 (2018) https://doi.org/10.1007/s10549-017-4595-8
18. Zidekova D. et al. Rapid screening test of the most frequent BRCA1/BRCA2 pathogenic variants in the NGS era. Neoplasma (2018) https://doi.org/10.4149/neo_2018_170507N328
19. Hindley A. et al. Significance of NPM1 gene mutations in AML. Int J Mol Sci 2021(22) 40 (2021) https://doi.org/10.3390/ijms221810040
20. Panferova A. et al. GATA1 mutational analysis and molecular landscape characterization in acute myeloid leukemia with trisomy 21 in pediatric patients. Int J Lab Hematol 43:713-723 (2021). https://doi.org/10.1111/ijlh.13451
21. Mizuta S. et al. cDNA-based mutation screening using a combination of high resolution melting curve and fragment analysis facilitates efficient CCR4 mutation analysis in adult T-cell leukemia/lymphoma. Am J Clin Pathol 154:336-351 (2020) https://doi.org/10.1093/AJCP/AQAA037
22. Vavrova E. et al. Fragment analysis represents a suitable approach for the detection of hotspot c.7541_7542delCT NOTCH1 mutation in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia Research 60:145-150 (2017). https://doi.org/10.1016/j.leukres.2017.08.001
23. Cavalcante GC et al. Analysis of 12 variants in the development of gastric and colorectal cancers. World J Gastroenterol 23(48):8533-8543 (2017) https://doi.org/10.3748/wjg.v23.i48.8533
24. Kim H et al. T-cell receptor rearrangements determined using fragment analysis in patients with T-acute lymphoblastic leukemia. Ann Lab Med 39:125-132 (2019)　https://doi.org/10.3343/alm.2019.39.2.125
25. Shetty O. et al. Comparison between fluorescence in-situ hybridization (FISH), reverse transcriptase PCR (RT-PCR), and fragment analysis, for detection of t(X;18)(p11;q11) translocation in synovial sarcomas. Indian J Pathol Microbiol 63:64-72 (2020) https://doi.org/10.4103/IJPM.IJPM_851_18　 https://journals.lww.com/ijpm/fulltext/2020/63010/comparison_between_fluorescence_in_situ.14.aspx
26. Friedrich C. et al. PCR-Fluo-ASXL1-FA: A fast, sensitive and inexpensive complimentary method to detect ASXL1 mutations in haematological malignancies. Int J Lab Hematol 44:928-933 (2022) https://doi.org/10.1111/ijlh.13931
27. Johnson B. et al. Characterization of the DNA sequence specificity, cellular toxicology and cross-linking properties of novel bispyridine-based dinuclear platinum complexes. BMC Cancer 16:333 (2016) https://doi.org/10.1186/s12885-016-2368-0
28. Johnson B. et al. The interactions of novel mononuclear platinum-based complexes with DNA. BMC Cancer 18:1284 (2018) https://doi.org/10.1186/s12885-018-5194-8
29. Abdella R. et al. BRCA1 and RAD51C promoter methylation in human resectable pancreatic adenocarcinoma. Clinics Research Hepatology Gastroenterology 46:101880 (2022) 　 https://doi.org/10.1016/j.clinre.2022.101880
30. Sun Y. et al. An improved advanced fragment analysis-based classification and risk stratification of pediatric acute lymphoblastic leukemia. Cancer Cell Int 19:110 (2019) https://cancerci.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12935-019-0825-y
31. Zhang H. et al. An advanced fragment analysis-based individualized subtype classification of pediatric acute lymphoblastic leukemia. Sci Rep 5:12435 (2015) https://doi.org/10.1038/srep12435

研究用にのみ使用できます。診断用には使用いただけません。