サンガーシーケンスの結果が“NNNNN”！？その結果、再解析で改善するかもしれません！

• By LatB Staff
• 06.27.2023

キャピラリーシーケンサでのランが終わり、いざシーケンスデータ（.ab1）を開いてみると、波形は確認できるものの、ベースコールされた塩基配列が”NNNNN”だったことはありませんか？

これはソフトウエアを用いて再度解析することによって、ベースコールし直すことができる場合があります。

そこで今回は、”NNNNN”となっているサンプルファイルを再解析する方法について、ご紹介いたします。

▼こんな方におすすめです！

• サンガーシーケンスを実施している方
• サンガーシーケンスデータのトラブルシュートに興味をお持ちの方

”NNNNN”となってしまう原因は？

正しくベースコールできていない場合、生データ「Raw」を見てみましょう。

• Sequencing Analysisソフトウエアの場合、「Raw」タブをクリックします。
  1. Sequencing Analysisソフトウエアを開く
  2. 「File」 ＞ 「Add Sample（s）…」をクリック
  3. 任意の.ab1ファイルを選択し、「Add Selected Samples >>」　＞ 「OK」をクリック
  4. 該当のサンプルファイルの「Show」にチェックをつける
  5. 「Raw」タブをクリック
     

     図2：Sequencing Analysisの場合のRaw

• Thermo Fisher™ Connect™ PlatformのQuality Checkの場合、1つのサンプルファイルをダブルクリックし、「Raw」タブをクリックします。
  1. Thermo Fisher Connect Platformにサインイン（https://apps.thermofisher.com/）
  2. 「Quality Check」 Appをクリック
  3. 「Create New Project」を選択後、「Type a project name」にプロジェクト名を入力し、「OK」をクリック
  4. 「Import From」 ＞ 「My Computer」をクリック
  5. 任意の.ab1ファイルを選択し、「Open」をクリック
  6. 左枠の「QC」をクリック
  7. 「Import Project Settings」で「No」を選択し、「Continue」をクリック
  8. 該当の1サンプルをダブルクリック
  9. 「Raw」タブをクリック
     

     図3：Quality Checkの場合のRaw

ターゲット配列が短いものの、長いターゲット用のランモジュールでランしているために、正しく解析できずに、解析不能”NNNNN”となっている場合が多いです。
この場合、短いターゲット用のランモジュールでランをすれば解消することがあります。
それでも解消しない場合や既に取得したデータファイルについては、以下の手順で再解析を試してみましょう。

Sequencing Analysis ソフトウエアでの再解析

• 手順1： Rawデータにて、最後のピークの位置を確認
  • Rawデータの波形の上にカーソルを移動し、ドラッグすると、十字の点線が表示されます。
  • ドラッグしたまま、最後のピークに移動し、横軸（データポイント）の数字を確認します。
  • 図4では最後のピークのデータポイントは「2548」です。
    

    図4：SeqAでのデータポイントの確認

• 手順2：「Stop」に確認したデータポイントを入力
  • 該当サンプルの「Stop」に手順1で確認した最後のピークのデータポイントを入力します。
  • 「Stop」はRawデータの解析終了ポイントですので、これで解析終了位置を指定し直すことになります。
  • 図4の結果であれば、「Stop」に「2548」を入力します。

• 手順3：再解析の実行
  • 該当のサンプルの「BC」にチェックをつけ、緑の三角ボタン（「Start」 > 「Start Analysis」）をクリックし、再解析を実行します。
    

    図5：SeqAでの再解析の実行

    

    図6：SeqAでの再解析後画面

  再解析後、「Electropherogram」タブをクリックし、波形とベースコールされた塩基を確認します。

  再解析したファイルは「File」 ＞ 「Save Sample（s）」で上書き保存することができます。

Quality Check Appでの再解析

• 手順1：サンプルファイルの選択
  • 「Traces」画面にて、再解析したいファイルのチェックボックスにチェックをつけます。

• 手順2：再解析条件の指定
  • 「Basecall」をクリックします。
  • 「Ending base and Calling Ns」をクリックし、「At PCR stop」のチェックボックスにチェックを付けます。

• 手順3：再解析の実行
  • 「Analyze」をクリックし、再解析を実行します。
    

    図7：QCでのサンプル再解析の実行

    

    図8：QCでの再解析後画面

  再解析後、サンプルをダブルクリックし、波形とベースコールされた塩基を確認します。

  解析したファイルは以下の手順で出力することができます。

  • 「Actions」 ＞ 「Export Traces」画面にて、「*.ab1」にチェック ＞ 「OK」をクリック

まとめ

• 短いターゲットを長いランモジュールで泳動すると”NNNNN”となることがある
• 生データ（Raw）を確認することで原因を推測できる
• ソフトウエアで再解析することで改善できる場合がある

“NNNNN”となったデータがありましたら、上記の手順をぜひお試しください。

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