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データ品質に影響する！？シーケンス反応産物の精製の重要性！！

作成者 03.02.2022

シーケンス反応産物を正しくクリーンアップすることは、サンガーシーケンスのワークフローで不可欠な操作です。クリーンアップなしでは、きれいなシーケンスデータを得ることができません。そこで今回は、シーケンス後のクリーンアップがどのように機能し、どのようなツールを使用できるのかをご紹介します。

▼こんな方におすすめです！
・これからシーケンス解析をはじめる方
・シーケンス反応後の精製を簡単に済ませたい方

また、下記動画をご覧いただくことでより理解を深めることができます。

シーケンス反応から蛍光検出までの流れ

反応に必要な各コンポーネントを含むApplied Biosystems™ BigDye™ Terminator Ready Reaction Mixと、DNAテンプレート、単一のプライマーを混合して、サイクルシーケンス反応を実施します。Ready Reaction Mixには異なる蛍光色素で標識された4種類のヌクレオチド（A、T、G、C）が含まれており、シーケンス反応中にこれらを取り込んだ蛍光標識断片が生成されます。
その後、クリーンアップしたサンプルをキャピラリーシーケンサーで泳動します。
シーケンス反応で生成された断片は電気的なインジェクションにより、キャピラリー内に取り込まれ、サイズや電荷、標識色素により分離されていきます。装置のレーザーで励起された標識色素から発する蛍光を装置のカメラで検出し、データ処理が行われます。

シーケンス反応後の精製ステップの必要性

シーケンス反応後にクリーンアップを行わない場合、あるいは、うまく行われなかった場合、反応で余った蛍光標識ヌクレオチドが残存し（残存色素）、下流の検出プロセスを妨害します。

残存色素は、蛍光標識断片と競合してキャピラリーに取り込まれる可能性があります。これによりシグナル強度の低下が引き起こされ、装置による明確なベースコールを妨げる可能性があります。その結果、生成されるデータの品質は低くなります。

そのため、シーケンス反応後に余分な蛍光標識ヌクレオチドを除去する精製ステップが必要です。

シーケンス反応後のクリーンアップの方法

シーケンス反応産物をクリーンアップするためによく行われているエタノール沈殿法は、労働集約的で時間がかかる可能性があります。そのためいくつかの異なる方法が開発されてきました。カラムベースとビーズベースの2つのクリーンアップ方法はエタノール沈殿よりも高価ですが、少ないピペッティング操作で完了し、エタノール沈殿よりも効果的な方法です。
カラムベースの方法は、取り込まれていない色素を基質に結合させ、遠心力を使用してシーケンス反応物を含む溶液を通過させる方法です。

ビーズベースの方法は、余った色素を結合するビーズを使用した方法です。当社ではApplied Biosystems™ BigDye XTerminator™ Purification Kitというビーズ精製キットを販売しています。

まとめ

・シーケンス反応後の精製はデータ品質上重要なステップ
・精製にはカラムやビーズを使ったキットを用いると効率的

シーケンシングに関するトピックには、Seq It Out動画シリーズもご活用いただけます。
https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/sequencing/sequencing-learning-center/sequencing-basics/seq-it-out-videos.html

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