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【第2回】エクソソームの濃縮・回収

Written by | Published: 04.28.2026

今回は、さまざまなサンプルからのエクソソームの濃縮・回収についてご説明します。また、実際の操作で役立つTipsや回収実験への考察についてもご紹介いたします。

現在、エクソソームの回収法として、超遠心機を用いたサイズ分画法が汎用されています。この方法は、ショ糖密度勾配やショ糖クッションを組み合わせ、比較的低密度のエクソソームを他の小胞や粒子から分離することを基にしています。これらの方法は、操作に8～30時間を要し、超遠心機が必要で、高度なテクニックが求められます。

サーモフィッシャーサイエンティフィックは、エクソソーム抽出操作を、短時間で簡便に行うために、スタートサンプルに応じて数種類のTotal Exosome Isolation Reagentを開発しました。この試薬を使用することで、培養液や血清などの体液サンプルから、単純な操作でインタクトな状態のエクソソームを回収できます。さらにスタート時のサンプル量に広く対応し、ハイスループットでの調製も可能です。

Total Exosome Isolation Reagentは、ポリマーによる排除体積効果によりナノ小胞の溶解性を低下させ、沈殿を促進する性質をも持っています。エクソソーム抽出では、サンプルに試薬を添加・混合し、4 ℃でインキュベート後、一般的な高速遠心（10,000 ×g）でペレット化させて回収します。エクソソームを含有するペレットは、PBSまたはその後のアプリケーションに適したバッファーに懸濁するだけで使用できます。

例えば、培養上清サンプルからのエクソソーム回収は、下記のように行います。

培養上清サンプルからのエクソソーム回収

Invitrogen™ Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) （製品番号：4478359）を使用。

【サンプルの前処理】

培養上清を回収し、遠心（2,000 ×g、30 min）で細胞や細胞デブリスをペレット化し、新しいチューブに上清を移す（ペレットが混入しないように注意する）。

【エクソソームの濃縮・回収】

  1. 培養上清サンプル量の0.5倍量（1/2量）のTotal Exosome Isolation Reagent（from cell culture media）を添加し、全体が均一になるまでよくミックスする。
    例：
    • 10 mLの培養上清に対して、5 mLのTotal Exosome Isolation Reagentを添加する。
    • 1 mLの培養上清に対して、500 μLのTotal Exosome Isolation Reagentを添加する。
  2. 1の混合液を2～8 ℃でovernightインキュベートする。
  3. 遠心処理（10,000 ×g、1時間、2～8 ℃）
  4. ピペッティングで上清をきれいに除去する。
    エクソソームはペレット化されて回収される。
    （ペレットが見えない場合があるので、注意する）
  5. ペレットを1×PBS または以後のアプリケーションに使用するバッファーで懸濁する。
    参考： 懸濁するバッファーの液量
    • スタート量が10 mLの場合、100 μL～1 mL
    • スタート量が1 mLの場合、25～100 μL
  6. エクソソームの保存
    • 2～8 ℃で最大1週間保存可能。
    • 長期保存の場合は、-20 ℃以下で保存する。

これ以外にも、さまざまなサンプルに対応する Total Exosome Isolation Reagentを提供しています。どのサンプルに対しても、超遠心機を使わずに短時間で簡単にエクソソームを回収できます。

操作Tips

  • 凍結サンプルを用いる場合は、25～37 ℃にセットしたウォーターバス中で完全に融解させ、融解後は氷中に置きます。
  • スタート時のサンプル量をマニュアルの指示よりもスケールアップしたい場合、回収効率を高める条件を検討する必要があります。主に遠心時間を延長することで対応してください。
  • 固定式のアングルローターで遠心処理した場合、エクソソームペレットはチューブの側面の広い領域にスメアー状に回収されると予想されます。そのため、遠心後にPBSやバッファーで懸濁する際は、ペレットが形成されていると思われるチューブ側面全体を対象に懸濁してください。ペレットが見えない場合も、操作は同様に行うことが必要です。
  • スイングバケットロータ―を用いて遠心処理を行った場合、ペレットはチューブの底の部分に形成されます（図1）。
図1. 2種類のローター使用時のペレット回収位置

図1. さまざまなサンプルから回収したサンプルの小胞サイズ

実験の考察ポイント

1．エクソソームの回収確認および濃度測定

エクソソームのサイズは30～100 nmと非常に小さいため、一般的な顕微鏡での確認は難しく、回収の確認は、 NanoSight™機器および電子顕微鏡が一般的です。これらの機器は共に10 nm程度のナノ粒子を観察することができます。一般的な光学顕微鏡では分解能に限界があるため、エクソソームサイズの粒子を個別に確認することは困難です。またエクソソームの濃度測定は、電子顕微鏡では困難なため、現行ではNanoSight機器などの特殊な機器が必要です(図2)。この機器を利用する場合も、より正確で再現性の高い濃度測定ができるように、サンプル中のエクソソーム濃度は2×108～8×108個/mLになるように希釈することをおすすめします（例：1回目の測定で、回収したエクソソームの濃度が8×109個/mLであった場合、10倍希釈して再度測定する）。

2．その他のエクソソーム回収の確認方法

最もシンプルな方法の一つは、回収された小胞のサイズが30～150 nmであることを確認することです。また 小胞の表面タンパク質(テトラスパニン類)に対してポジティブであることも確認方法として用いられています。CD63, CD81およびCD9などがマーカーとして最も広く利用されています。回収した小胞がエクソソームであるという確認をする方法として、ウェスタンブロティングが比較的簡単な方法です。ただし、現時点でも、エクソソームの定義は確定されておらず、この分野では絶対的なコンセンサスが取れていません。そのため、エクソソームを含めた全てのnanovesicle(ナノ小胞)およびmicrovesicle(小胞)について、厳密な分画方法とそれぞれの特徴分けはまだできていません。

3．予想回収量

回収されるエクソソーム数はサンプルによって大きく異なります。一般的に体液からは1.0× 108～1.0×1011個/mLのエクソソームが回収されることが予想されます。特に血液（血清・血漿）中には大量のエクソソームが存在しており、血清サンプルの場合、100 µLのスタートサンプルから1.5×1011～3×1011個のエクソソームが回収されます。

培養細胞については、培養条件によって回収量が変動します。当社のテストでは、 T175フラスコで30 mLの培地(エクソソーム除去済みFBSを添加)で培養した場合、約2×107個の細胞由来の培養上清１ mLからTotal Exosome Isolation Reagent（from cell culture media）を用いて、約4×109～8×109個のエクソソームが回収できました。回収されるエクソソームの数は用いる細胞株によって若干異なります。また培養に用いた培地によっても異なります（注： FBSはエクソソーム除去済みのものを使用してください）。

さまざまなサンプルから回収したサンプルの小胞体サイズ

図2. さまざまなサンプルから回収したサンプルの小胞サイズ

9種類のサンプルからTotal Exosome Isolation Reagent、もしくは超遠心法を使って、エクソソーム分画を回収し、小胞のサイズと濃度をNanoSight機器で測定しました。全てのサンプルにおいて、回収量はTotal Exosome Isolation Reagentが多い結果となりました。一方で回収されたエクソソームのサイズとその分布はほぼ同じでした。 PK：Proteinase K

関連リンク

NanoSight is a trademark of Malvern Panalytical Ltd.

 

研究用にのみ使用できます。診断用には使用いただけません。

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