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Accelerating ScienceLearning at the Bench / 分子生物学実験関連 / そういうことだったのか ! ゲノム編集実験(CRISPR/Cas9) ~第3回 3つのCRIPSR/Cas9実験系~

そういうことだったのか ! ゲノム編集実験(CRISPR/Cas9) ~第3回 3つのCRIPSR/Cas9実験系~

Written by LatB Staff | Published: 05.08.2023

ゲノム編集の初心者Aさんによる「初めてのゲノム編集実験」。第1回、第2回を通して基礎的な内容を理解したAさんは、いよいよ実験を始めようとしています。

Aさん:
ガイドRNAがデザインできました!
これで培養細胞のノックアウト実験ができますね

先輩:
待って。その前にCIRSPR/Cas9の3つの実験系からちゃんと選んだ?

Aさん:
3つの実験系って?

供与方法、つまり「Cas9とガイドRNAをどうやって細胞に与えるか」には、3つ方法があります。実験を行う前に、この3種類のどの方法で実施するか、選択しておきましょう。

  • DNA(Vector)方法:
    第一世代。Cas9とガイドRNA両方の配列をDNA(Vector)に組み込んで、細胞に供与する方法
  • RNA(Cas9 mRNA)方法:
    第二世代。Cas9とガイドRNAを、それぞれRNAの状態で細胞に供与する方法
  • Protein(Cas9 protein)方法:
    Cas9 をCas9 タンパク質、ガイドRNAをRNAとして細胞に供与する方法

Aさん:
つまり、材料の作り方が違うんですね。
ってことは、細胞内の動きも違うんですか?

先輩:
いい質問だね。図1を見てみよう。3つの方法の細胞内挙動の違いが説明してあるよ

3つの方法で導入されたCas9とガイドRNAが細胞内で核内に移行するまで

図1: 3つの方法で導入されたCas9とガイドRNAが
細胞内で核内に移行するまで

DNA(Vector)方法では、vectorが細胞内に導入されると、核に移行したvectorからガイドRNAとCas9 mRNAが転写され、細胞質でCas9 タンパク質が翻訳されます。その後、細胞質内でガイドRNAとCas9タンパク質がコンプレックスを形成して、Cas9 proteinの核移行シグナルによって核内に移行します。
RNA方法は、ガイドRNAとCas9 mRNAを同時に導入します。細胞質に導入されたCas9 mRNAがCas9タンパク質に翻訳され、ガイドRNAとコンプレックスを形成して、核に移行します。
Protein方法でも、ガイドRNAとCas9タンパク質を同時に導入します。細胞質に導入されたガイドRNAとCas9タンパク質がコンプレックスを形成後、核に移行します。
3つの方法いずれも、核内移行後はガイドRNAが目的遺伝子に結合して、ゲノムを切断します。

Aさん:
なるほど。
で、結局どれが一番お勧めなんですか?

先輩:
うん、それが知りたいよね。ゲノム編集の効率が高い方法は、Protein方法だよ

「ゲノム編集効率が高い」とは、「切断した後に変異が入る効率が高い」ことを指します。
ゲノム編集効率が高い方法は、Protein方法です。
第2世代のRNA方法はDNA(Vector)方法のゲノム編集効率を改善した方法のため、DNA方法よりもRNA方法の方がゲノム編集効率は高いです。

Aさん:
ところで、Protein方法のトランスフェクション効率はどうなんでしょう。
オフターゲット効果も気になります。

そう、供与方法を選ぶときは、ゲノム編集効率のほか、トランスフェクション効率やオフターゲット効果も考えなくてはなりません。トランスフェクション効率で軍配が上がるのはDNA(vector)方法です。選択マーカー(蛍光タンパク質や薬剤抵抗タンパク質)が掲載されているので、導入された細胞の濃縮や導入効率の確認がしやすいです。一方、Protein方法はDNA方法と比べて、一般的にトランスフェクション効率は高くありません。そのため、培養細胞に効率よくCas9タンパク質が導入できるのか、あらかじめ確認が必要です。

また、オフターゲット効果はProtein方法が最も低いです。これは、タンパク質が細胞内に残りづらく、ターゲット以外の遺伝子に作用しづらいためだと言われています。

先輩:
3つの方法をまとめてみたよ

  • ゲノム編集効率の高さ:Protein>RNA>DNA(Vector)
  • オフターゲット効果の低さ:Protein>RNA>DNA(Vector)
  • トランスフェクション効率の高さ※:DNA(Vector)>RNA>Protein
    ※比較が難しく、直接比較したデータがないため、原理から推測される順番です。

Aさん:
じゃあ、Protein方法で試してみます!
えっと、実験に必要なのは…

先輩:
まずは大事な2つ。
ガイドRNAとCas9 Proteinだね。

供与方法が決まったら、表1を参考にしてCas9とガイドRNAを用意しておきましょう。

表1 Cas9とガイドRNAの準備方法
Cas9 ガイドRNA 備考
DNA方法
(Vector)
Invitrogen™ GeneArt™ CRISPR vectorシステム Invitrogen™ TrueDesign Genome Editorなどで配列をデザインし、Primer合成などで入手※ CRISPR vectorは哺乳類細胞用のvectorのため、哺乳類細胞以外のサンプルの場合は、その細胞種に対応したvectorをご用意ください。
RNA方法 Invitrogen™ GeneArt™ Cas9 mRNA Invitrogen™ TrueGuide RNA(デザインサイト)でSpCas9用ガイドRNAが入手可能 Cas9 mRNAはSpCas9 mRNAで、核移行シグナルが付与
Protein方法 TrueCut Cas9 Protein Invitrogen™ TrueCut Cas9 ProteinはSpCas9 Proteinで、核移行シグナルが付与

※3’末端側に配列の付加が必要など、いくつか注意点があります。ガイドRNAを合成する前に、必ずCRISPR vectorのプロトコルから詳細を確認してください。

Aさんは表1を参考にして、Cas9 ProteinとガイドRNAを手に入れることにしました。次回は用意したCas9とガイドRNAを用いて、Aさんがいよいよトランスフェクションに挑みます。

まとめ

  1. CRISPR/Cas9システムには3つの供与方法(DNA(Vector)、RNA、およびProtein方法)がある
  2. Protein方法がゲノム編集効率が高く、オフターゲット効果も低い

Aさんが初めてのゲノム編集に挑戦するシリーズ第4回では、トランスフェクションのポイントについてご紹介します。

<ゲノム編集実験シリーズ>
そういうことだったのか ! ゲノム編集実験(CRISPR/Cas9) ~第1回 CRISPR/Cas9システムの原理~
そういうことだったのか ! ゲノム編集実験(CRISPR/Cas9) ~第2回 ガイドRNAのデザイン~
そういうことだったのか ! ゲノム編集実験(CRISPR/Cas9) ~第3回 3つのCRIPSR/Cas9実験系~
そういうことだったのか ! ゲノム編集実験(CRISPR/Cas9) ~第4回 トランスフェクション~
そういうことだったのか ! ゲノム編集実験(CRISPR/Cas9) ~第5回 変異の確認方法~
そういうことだったのか ! ゲノム編集実験(CRISPR/Cas9) ~第6回 オフターゲット効果~
そういうことだったのか ! ゲノム編集実験(CRISPR/Cas9) ~第7回 ノックイン~

<ゲノム編集の基礎的な内容>
ゲノム編集の原理と手引き

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詳しくはこちら

 

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