そういうことだったのか ! ゲノム編集実験（CRISPR/Cas9） ～第3回　3つのCRIPSR/Cas9実験系～

Aさん：
ガイドRNAがデザインできました！
これで培養細胞のノックアウト実験ができますね

先輩：
待って。その前にCIRSPR/Cas9の3つの実験系からちゃんと選んだ？

Aさん：
3つの実験系って？

供与方法、つまり「Cas9とガイドRNAをどうやって細胞に与えるか」には、3つ方法があります。実験を行う前に、この3種類のどの方法で実施するか、選択しておきましょう。

• DNA（Vector）方法：
  第一世代。Cas9とガイドRNA両方の配列をDNA（Vector）に組み込んで、細胞に供与する方法
• RNA（Cas9 mRNA）方法：
  第二世代。Cas9とガイドRNAを、それぞれRNAの状態で細胞に供与する方法
• Protein（Cas9 protein）方法：
  Cas9 をCas9 タンパク質、ガイドRNAをRNAとして細胞に供与する方法

Aさん：
つまり、材料の作り方が違うんですね。
ってことは、細胞内の動きも違うんですか？

先輩：
いい質問だね。図1を見てみよう。3つの方法の細胞内挙動の違いが説明してあるよ

図1： 3つの方法で導入されたCas9とガイドRNAが
細胞内で核内に移行するまで

DNA（Vector）方法では、vectorが細胞内に導入されると、核に移行したvectorからガイドRNAとCas9 mRNAが転写され、細胞質でCas9 タンパク質が翻訳されます。その後、細胞質内でガイドRNAとCas9タンパク質がコンプレックスを形成して、Cas9 proteinの核移行シグナルによって核内に移行します。
RNA方法は、ガイドRNAとCas9 mRNAを同時に導入します。細胞質に導入されたCas9 mRNAがCas9タンパク質に翻訳され、ガイドRNAとコンプレックスを形成して、核に移行します。
Protein方法でも、ガイドRNAとCas9タンパク質を同時に導入します。細胞質に導入されたガイドRNAとCas9タンパク質がコンプレックスを形成後、核に移行します。
3つの方法いずれも、核内移行後はガイドRNAが目的遺伝子に結合して、ゲノムを切断します。

Aさん：
なるほど。
で、結局どれが一番お勧めなんですか？

先輩：
うん、それが知りたいよね。ゲノム編集の効率が高い方法は、Protein方法だよ

「ゲノム編集効率が高い」とは、「切断した後に変異が入る効率が高い」ことを指します。
ゲノム編集効率が高い方法は、Protein方法です。
第2世代のRNA方法はDNA（Vector）方法のゲノム編集効率を改善した方法のため、DNA方法よりもRNA方法の方がゲノム編集効率は高いです。

Aさん：
ところで、Protein方法のトランスフェクション効率はどうなんでしょう。
オフターゲット効果も気になります。

そう、供与方法を選ぶときは、ゲノム編集効率のほか、トランスフェクション効率やオフターゲット効果も考えなくてはなりません。トランスフェクション効率で軍配が上がるのはDNA（vector）方法です。選択マーカー（蛍光タンパク質や薬剤抵抗タンパク質）が掲載されているので、導入された細胞の濃縮や導入効率の確認がしやすいです。一方、Protein方法はDNA方法と比べて、一般的にトランスフェクション効率は高くありません。そのため、培養細胞に効率よくCas9タンパク質が導入できるのか、あらかじめ確認が必要です。

また、オフターゲット効果はProtein方法が最も低いです。これは、タンパク質が細胞内に残りづらく、ターゲット以外の遺伝子に作用しづらいためだと言われています。

先輩：
3つの方法をまとめてみたよ

• ゲノム編集効率の高さ：Protein＞RNA＞DNA(Vector)
• オフターゲット効果の低さ：Protein＞RNA＞DNA(Vector)
• トランスフェクション効率の高さ^※：DNA(Vector)＞RNA＞Protein
  ※比較が難しく、直接比較したデータがないため、原理から推測される順番です。

Aさん：
じゃあ、Protein方法で試してみます！
えっと、実験に必要なのは…

先輩：
まずは大事な2つ。
ガイドRNAとCas9 Proteinだね。

供与方法が決まったら、表1を参考にしてCas9とガイドRNAを用意しておきましょう。

※3’末端側に配列の付加が必要など、いくつか注意点があります。ガイドRNAを合成する前に、必ずCRISPR vectorのプロトコルから詳細を確認してください。