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【やってみた】フローサイトメーターでミネラルウォーター中の微生物を生死判定してみた

作成者 05.16.2017

はじめに

ミネラルウォーターなどの飲料水に含まれる微生物の生死判定を行う場合、従来であれば希釈したサンプル液をプレートに撒いて長時間培養後、コロニー形成数をカウントします。またリアルタイムPCRなどを用いても生菌・死菌の両方が検出されるため不向きです。今回は、Invitrogen™ LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability and Counting KitとInvitrogen™ Attune™ Acoustic Focusing Cytometerを用いて、ミネラルウォーター中に含まれる菌の生死の判定測定しました。

サンプルの準備

サンプルに含まれる微生物は106 cells/mL 以下になるように適切なバッファーで希釈します。（濃度が未知の場合は段階希釈したサンプルをご使用ください。）
希釈済みミネラルウォーター 997 μL
↓ +SYTO 9 （3.34 mM） 1.5 μL
↓ +Propidium iodide （PI ：30 mM） 1.5 μL
↓ 室温, 15 min, 遮光
Attune Acoustic Focusing Cytometer にて測定

結果

live-dead-analysis-of-bacteria-in-water-with-flowcytemeter-fig1

測定のコツ

  • 検体を希釈するバッファー（生理食塩水や水）などは予め0.22 um のフィルターでろ過します。
  • 微生物は、前方散乱光によるサイズ解析ではノイズと区別するのが難しいため、まずバッファーのみでノイズ（バックグラウンド）の位置を確認します。次にBL1 にThreshold（閾値）を設定して、蛍光を発しているポピュレーションのみを解析します。

SYTO 9とPIについて

LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability and Counting Kitには、核酸に結合することで蛍光を発する試薬のSYTO 9とPIが含まれています。SYTO 9は、細胞膜透過性のため全菌の判定に使用します。PIは細胞膜への透過性が無いため、生細胞は染色されず、細胞膜の傷ついた細胞や死細胞を染色します。したがってSYTO 9とPIを組み合わせることで、サンプル中に含まれる菌の生死の判定を行うことができます。
live-dead-analysis-of-bacteria-in-water-with-flowcytemeter-fig2

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