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フローサイトメトリーを用いた藻類の生死判別

Written by | Published: 06.09.2020

近年、微細藻類は、食品や代替燃料、化学物質の原材料として注目されています。微細藻類を用いた栄養食品や医薬品を安定的に供給するためには、持続的で安価な生産が重要となります。そのため、現在これらの原材料となる微細藻類の研究分野は急速に成長しています。
微細藻類の培養は、一般的に種類に応じてレースウェイポンドやフォトバイオリアクター、発酵槽などを用いて浮遊させながら行います。培養システムを微細藻類の培養に影響を与えることなくモニターできることが、藻類を利用した生産物の安定供給には必要不可欠です。フローサイトメトリーは、この微細藻類の状態をモニターするのに最適なツールの一つであると言えます。

そこで今回は、Invitrogen™ SYTOX™ Green Dead Cell Stain, for flow cytometryとInvitrogen™ Attune™ NxT Flow Cytometerを用いて、培地中の微細藻類であるNannochloropsis oculataの生死判別測定をご紹介いたします。Attune NxT Flow Cytometerは、超音波を使ったアコースティックフォーカシングにより、大型で粘性のある藻類培養物でも目詰まりを最小限に抑え、高速で処理する能力を持っています。オートサンプラーと合わせて使用することで、ハイスループットなスクリーニングが可能となります。

▼こんな方におすすめです！
・微細藻類の研究をされている方
・食品、製薬企業関係者様
・バイオ研究を行っている研究施設の共通機器室管理者様

用意するもの

・Invitrogen™ SYTOX™ Green Dead Cell Stain (製品番号　S34860)
・Thermo Scientific™ Burnstead™ Nanopure™装置を用いて浄水した超純水（Nanopure water）
※一般的な超純水であれば可
・Thermo Scientific™ Barnstead™ Nanopure™ waterThermo Scientific™ Nanopure™ water
・人工海水培地で培養したN. oculata　を約1 mL
・Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4
・Invitrogen™ Attune™ NxT Flow Cytometer

測定手順

1. 400 µLのN. oculate培養液を20秒間電子レンジにかけ、死細胞サンプルを作成します。
2. 電子レンジをかけた培養液が室温に戻るまで静置します。
3. 10 µLのSYTOX Green stain (濃度5 mM)を990 µLのNanopure waterに希釈し、終濃度50 µMのSYTOX Green stain working溶液を調製します。
4. 95 µLのN. oculate培養液（※）と5 µLのSYTOX Green stain working溶液を混ぜ、測定サンプルを調製します。※必要に応じて、手順1,2で調製した死細胞サンプルを混ぜ合わせます。
5. 4で調製したサンプルを室温遮光で30分静置します。
6. 5で調製したサインプルをPBS, pH 7.4で20倍希釈し、Attune NxT Flow Cytometerで測定します。

測定結果

通常のN. oculata 培養溶液を測定すると、死細胞を示すSYTOX stain (+)の割合は10％未満です。
N. oculata 培養溶液を20秒間電子レンジ処理することにより、死細胞の割合を大幅に増加（SYTOX stain (+)の割合は95.65%）させ、これを死細胞サンプルとしました。

 

通常のN. oculata培養溶液と死細胞サンプルの溶液を4:1, 1:1, 1:4で混ぜ合わせたサンプルをそれぞれ測定しました。結果は、上記の図表のように同様の比率で生細胞(SYTOX stain (-))と死細胞(SYTOX stain (+))が検出されました。

まとめ

・SYTOX Green Dead Cell Stain, for flow cytometryとAttune NxT Flow Cytometerを使用して、N. oculata培養溶液中の生細胞と死細胞の比率を、サンプル採取から染色、測定まで簡単に測定することができました。
・Attune NxT Flow Cytometer独自の超音波を使ったアコースティックフォーカシングにより、粘性のある藻類培養物でも目詰まり無く測定することができました。
・Attune NxT Flow Cytometerを使用すれば、溶液中の微細藻類の細胞数、生死比率、微細藻類の濃度、1分間に最大1 mLの培養液を測定することができます。

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