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Tecnología de placa de matriz microfluídica
PCR digital potente y sencilla
La compartimentación es la base de la PCR digital
En la introducción de esta tecnología en 1988, se utilizó una placa de 384 pocillos para demostrar los principios de "dilución limitante" durante la detección de objetivos raros (1). A medida que han evolucionado las técnicas de amplificación y cuantificación del ADN mediante PCR digital (dPCR), también han evolucionado los métodos de distribución o compartimentación de reactivos. Uno de los métodos más comunes disponibles en la actualidad es el uso de la tecnología microfluídica para crear multitud de diminutas reacciones aisladas mediante la emulsificación en gotas. Esto permite generar decenas de miles de gotas de volumen mucho más reducido por reacción de dPCR. El aumento del número de gotas mejora la capacidad de detección de objetivos raros y la precisión en caso de objetivos de concentración más altos lo que, básicamente, amplía el intervalo dinámico (2,3).
PCR digital precisa y exacta
El sistema de PCR digital QuantStudio Absolute Q de Applied Biosystems se basa en su tecnología de placa de matriz microfluídica (MAP) exclusiva para ofrecer resultados de dPCR de alta precisión. Veamos cómo funciona:
La MAP (Figura 1) tiene 16 unidades de reacción de dPCR, que se distinguen fácilmente como cuadrados opacos. Si ampliamos la imagen, cada unidad de reacción de dPCR (cuadrado opaco) se compone de 20 480 microcámaras de matriz fija. Las propias microcámaras están conectadas por una red de distribución empleada para suministrar reactivos de PCR. Una vez que los reactivos se han compartimentado en las microcámaras, la amplificación de PCR se ejecuta y se realiza un recuento del número de microcámaras en el que la amplificación de ADN se realizó correctamente.
Mayor uniformidad que otros métodos de dPCR
Algunas tecnologías de PCR digital basadas en emulsión o gotas (ddPCR) sufren deficiencias de uniformidad debido a la dependencia de un proceso estocástico inherente (el cizallamiento de líquidos) para crear compartimentos individuales. Esto puede provocar una alta variabilidad en el número total de compartimentos generados por reacción de dPCR.
Por otra parte, la tecnología MAP de QuantStudio Absolute Q no depende de la cizalladura de líquidos basada en gotas ni del desplazamiento físico de los reactivos excedentes para formar compartimentos o microcámaras. Por lo tanto, además de ofrecer una uniformidad superior, reducir los residuos de reactivos y simplificar el flujo de trabajo, la tecnología MAP incrementa significativamente la precisión de volumen general, el número de microcámaras generadas y la exactitud de la cuantificación.
Una ojeada a los datos
Para demostrar el tipo de datos generados por la placa MAP16 en el sistema QuantStudio Absolute Q, utilizamos un ensayo multiplex en el que se emplearon los cuatro canales ópticos del sistema QuantStudio Absolute Q para detectar los siguientes objetivos: Target 1 (FAM), Target 2 (VIC), Target 3 (ABY) y Target 4 (CY5). La figura 2 muestra los gráficos de fluorescencia dPCR y mapas resultantes de la positividad de microcámara generados por el software de análisis QuantStudio Absolute Q a partir de una sola reacción en la placa MAP16.
Generación de 20 000 microreacciones de dPCR, cada vez
Para destacar la excepcional uniformidad del llenado de microcámaras, realizamos un estudio para demostrar la repetibilidad de recuentos de alta aceptación de microcámaras en el MAP para diferentes ensayos (Figura 3). Para este estudio analizamos 14 placas mediante ensayos de control de calidad estándar internos. En el flujo de trabajo de dPCR, una vez que esta ha finalizado, el software de análisis QuantStudio Absolute Q detecta e inspecciona cada microcámara dentro de una reacción o matriz de dPCR mediante un canal de control de calidad y, a continuación, sólo acepta aquellas microcámaras con relleno uniforme y sin signos obvios de residuos de autofluorescencia no relacionada con PCR. A lo largo de las 14 placas incluidas en el estudio, identificamos una aceptación media de microcámara del 99,7 % (±0,6 %). Se trazó el número total de microcámaras aceptadas por matriz en cada una de las 14 MAP para demostrar la uniformidad general en cada una de las placas. La línea discontinua en 20 480 indica el número total de microcámaras disponibles en la MAP. En todas las matrices hemos observado un promedio de 20 417 (±133) microcámaras aceptadas por placa.
Haga clic en la imagen para ampliarla Figura 3.
¿Por qué es importante el número de microcámaras analizadas?
Porque las estadísticas son esenciales para el análisis de dPCR.
Mediante el modelado de Poisson (anterior), tanto el número total de microcámaras analizadas como el volumen de cada microcámara se utilizan para calcular las concentraciones finales a partir de las reacciones de dPCR. Por lo tanto, es fundamental que ambas variables sean extremadamente uniformes y se calculen con precisión. La tecnología MAP mejora la uniformidad en las microcámaras totales aceptables, la precisión general del volumen y, como resultado, la cuantificación general.
Recursos adicionales
Referencias
- Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988;239(4839):487‐491.
- Huggett JF, Foy CA, Benes V, et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin Chem. 2013;59(6):892‐902.
- Quan PL, Sauzade M, Brouzes E. dPCR: A Technology Review. Sensors (Basilea). 2018;18(4):1271.
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