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I部分: 向DNA样本说再见——常见琼脂糖凝胶电泳错误

1. 使用水代替凝胶缓冲液或电泳缓冲液

琼脂糖凝胶配制和电泳通常使用TAE或TBE缓冲液进行。 如果您使用水进行凝胶配制和跑电泳,您的凝胶将在电泳时很快融化。 TAE、TBE和水都是透明的溶液;因此,在配制时请检查容器的标签。

2. 使用了错误浓度的琼脂糖

DNA凝胶电泳所需的标准琼脂糖浓度为1.0%。浓度越高,小条带的分辨率越高;反之,琼脂糖浓度越低,大分子量条带的分辨率和分离程度越高。 如果使用了错误浓度的琼脂糖凝胶,就很难确定DNA条带的可靠性。 当使用低百分比浓度琼脂糖凝胶时要小心;它们往往较软,更容易破损。

3. 颠倒了电泳槽与电源连接线的方向

这是很容易犯的错误,但是如果你不小心颠倒了电泳槽与电源连接线的方向,结果将会非常令人沮丧。 因为样本会向相反方向移动,而且由于上样孔与凝胶的末端很近,您会丢失所有的样本。 开始您的电泳后确保DNA样本以正确的方向进入凝胶;如果您看到您的条带向错误的方向移动,请颠倒电源线的方向。

II部分: 琼脂糖凝胶中实现更高分辨率的5种方法

1. 什么是适合于您的琼脂糖凝胶电泳的正确缓冲液?

进行DNA琼脂糖凝胶电泳所需的缓冲液类型,主要取决于DNA片段大小和电泳后的应用。 进行琼脂糖凝胶电泳最常见的两种缓冲液是Tris-乙酸EDTA缓冲液(TAE)Tris-硼酸EDTA缓冲液(TBE)。 因为两种缓冲液的pH值都接近中性,所以缓冲液中的DNA都带净负电荷并向凝胶装置正极(+)方向移动。

对于小片段DNA (<1000 bp),如果没有计划从凝胶中回收DNA,那么推荐使用1x TBE缓冲液。 TBE溶液具有高离子强度和缓冲能力。 TAE缓冲液,结合低电场强度(1–2 V/cm),最适于分离大DNA(12–15 kb)。 TAE缓冲液与琼脂糖相互作用,相比较TBE缓冲液中的琼脂糖凝胶,会产生更低的电渗透,更大的表面孔经,和更低的电场强度,可降低大DNA的smear现象。

2. 为了获得最好的分辨率您需要的DNA上样量是多少?

DNA样本量可以是各种各样的,关键是您正在分离的DNA条带的DNA含量。 最小可能被检测的DNA的量依赖于所使用的染色方法(例如,使用SYBR® Safe DNA凝胶染色可以检测出 3 ng的DNA。 一个清晰且界限分明的条带中DNA最大量为100 ng。

3. 凝胶配制如何影响条带分辨率?

推荐的琼脂糖凝胶厚度为3-4 mm;厚度超过5mm的凝胶会产生模糊的条带和更高的染色背景。与此类似,覆盖在电泳装置中凝胶上的电泳缓冲液厚度为3-5mm。 缓冲液太多会降低DNA迁移率并造成条带变形。


梳齿的厚度也很重要,它会显著影响分辨率。 薄梳(1 mm)会给出界限清晰的条带,而厚梳会产生厚条带,导致分辨率降低。 梳齿应充分清洗以去掉可能的残留物,否则可能会在泳道内产生波浪线。 此外,在去除梳齿前要先加入缓冲液,以减少琼脂糖孔附近的撕裂。

4. 凝胶类型影响条带分辨率吗?

根据DNA的应用和大小,琼脂糖类型会影响DNA分辨率。 凝胶强度,凝胶融解温度,和电渗透是选择合适琼脂糖时的重要因素。 Thermo Fisher提供一系列的琼脂糖类型,专为特定片段大小和应用的优化结果而设计。

  • UltraPure™琼脂糖是具有标准融解温度的多用途琼脂糖,专为常规分离分析而设计。 UltraPure™ 琼脂糖可分离500 bp至23,000 bp范围内DNA和RNA。
  • UltraPure™琼脂糖1000专为PCR片段和其它短DNA片段提供更高的分辨率的凝胶。 琼脂糖1000更容易操作,因为它具有更强的凝胶结构: 凝胶强度超过1,400 g/cm²。
  • 作为低熔/凝固温度的琼脂糖,UltraPure™低熔点琼脂糖被推荐用于快速DNA凝胶提取方案。 此琼脂糖分离范围为50 bp至1,000 bp。

5. 您如何选择琼脂糖凝胶电泳运行环境?

推荐的凝胶电泳装置内的电压是4–10 V/cm(正极和负极之间的距离,不是凝胶长度)。 如果电压太低,迁移率会降低,而且条带会因扩散而变宽。 如果电压太高,条带分辨率会降低,这主要是由于凝胶过热引起的。

核酸电泳教学资源

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