此应用程序可计算引物的 Tm 值并评估使用不同 DNA 聚合酶时合适的退火温度。此计算器的使用方法

注意事项:
如果 PCR 引物含有所需的错配(例如,用于创建突变位点或添加限制性酶切位点),需务必计算正确配对的序列的 Tm。

1. Select your DNA polymerase

Platinum SuperFi DNA polymerase
Phusion or Phire DNA polymerase
Taq-based DNA polymerase

2. Select input method

Single pair
Batch

3. Type or paste your sequence

4. PCR Conditions

µM
mM

热门的 DNA 聚合酶

Tm 计算器使用方法

此计算器可根据 PCR 反应所使用的引物对序列、引物浓度和 DNA聚合酶,计算出建议的引物 Tm(溶解温度)和 PCR 退火温度。此计算器还可计算引物长度、GC 百分比含量、分子量和消光系数。

此应用根据三种不同的方法计算 Tm

改良的 Allawi &SantaLucia 热力学方法 (1)适于计算使用 Platinum SuperFi DNA 聚合酶反应的 Tm 和退火温度。其参数针对一组引物进行了调整,以实现最高的特异性,同时保持 Platinum SuperFi DNA 聚合酶的高得率。

改良的 Breslauer 热力学方法 (2) 适于计算使用 Phusion 或 Phire DNA 聚合酶反应的 Tm 和退火温度。

另有一种方法适于计算使用基于 Taq 聚合酶反应的 Tm 和退火温度。

使用此计算器时,请先选择您的 DNA 聚合酶,然后输入或粘贴您的引物序列,再提供引物终浓度。Tm 值、退火温度及其他数据即可自动计算出来。

如有必要,可采用温度梯度进一步优化并根据经验确定各个模板-引物对组合的最佳退火温度。退火温度梯度应首先比计算器生成的退火温度低 6-10°C,然后逐渐增加到延伸温度(两步法 PCR)。

  1. Allawi, H. T., and SantaLucia, J. (1997).Thermodynamics and NMR of internal G-T mismatches in DNA.Biochemistry, 36(34), 10581-10594.
  2. Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., and Marky, L. A. (1986).Predicting DNA duplex stability from the base sequence.Proceedings of the National Academy of Sciences, 83(11), 3746-3750.