Maxima Reverse Transcriptases

Thermo Scientific Maxima反转录酶通过分子改造而得到,可实现最高的cDNA合成性能。我们的专利技术引入多种有利的突变,显著改善了这些酶的热稳定性、扩增效率和持续合成能力,从而提高cDNA合成性能。Maxima反转录酶有多种形式,可用于RT-PCR和RT-qPCR,包括单酶、经过优化的试剂盒和极其方便的预混液。Maxima反转录酶试剂盒和预混液还具有完整的gDNA去除步骤,工作流程简单高效。

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在2步法RT-qPCR中高效完成反转录

我们全新的Thermo Scientific Maxima H Minus cDNA合成预混液可在2步法RT-qPCR中提供始终如一的高效和可重复的反转录。为了给您的cDNA合成带来最高价值,这种方便的单管式预混液配方中加入了一种工程化RNase H酶——Maxima H Minus反转录酶——其简单的方案可为您的RT-qPCR带来一致性,并实现最大控制。

为什么使用预混液?

  • 反应组装更方便
  • 有助于减少多个步骤带来的移液差异,提高RT-qPCR数据的准确性
  • 降低样品之间发生交叉污染的风险

为什么使用Maxima H Minus反转录酶?

  • 是通过分子改造得到的工程化MMuLV(莫洛尼鼠白血病病毒)反转录酶
  • 更高热稳定性
  • 更快合成速率
  • 持续合成能力提高50倍
  • 无RNase H活性
  • 已证明比竞争产品的灵敏度更高

在较宽的动态范围内具有高转录效率

Maxima H Minus cDNA合成预混液可在较宽的模板浓度范围内保持高转录效率和良好的线性(图1)。良好的线性表明,无论使用大量还是少量起始RNA,都能可靠代表不同转录物的相对数量。


图1. Maxima H Minus cDNA合成预混液的广泛动态范围。
标准曲线在宽的起始RNA范围内具有高度线性度(R2 = 0.999),这表明无论总RNA丰度是多少,特定RNA转录物的相对代表性在cDNA库中得以保留。将HeLa细胞总RNA进行10倍连续稀释(1 μg至0.1 pg),然后对人18S RNA基因进行扩增。使用Maxima H Minus cDNA合成预混液生成第一链cDNA。使用Thermo Scientific Luminaris Probe qPCR预混液(低ROX),在Applied Biosystems ViiA 7实时PCR系统上扩增cDNA。

 

一致的转录效率

在使用少量和大量起始RNA时,Maxima H Minus cDNA合成预混液都比其他品牌的反转录酶具有更高的效率(图2)。转录效率越高,RNA使用量越少,并且能够准确检测低表达的转录物。

图2. Maxima H Minus cDNA合成预混液的转录效率更强。在广泛的RNA起始量范围内,Maxima H Minus cDNA合成预混液比其他品牌的反转录酶具有更高的效率。将HeLa细胞总RNA进行10倍连续稀释(1 μg to 0.1 pg),然后对人18S RNA基因进行扩增。使用Maxima H Minus cDNA合成预混液、用于RT-qPCR 的Thermo Scientific Maxima第一链cDNA合成试剂盒以及来自其他四家供应商的反转录酶,生成第一链cDNA。使用Luminaris Probe qPCR预混液(低ROX),在ViiA 7实时PCR系统上扩增cDNA。扩增曲线表示ΔRn随循环数的变化。

对靶标阵列实现一致、可靠的转录

使用Maxima第一链cDNA合成试剂盒得到的RT-qPCR数据进行归一化处理后发现,在RT-qPCR中96个靶基因中,Maxima H Minus cDNA合成预混液始终比其他供应商的反转录酶预混液具有更高的效率(图3)。

图3. Ct值一致降低。在广泛的靶标范围内,Maxima H Minus cDNA合成预混液比其他市售预混液具有更高的cDNA合成效率。使用96基因Applied Biosystems TaqMan®检测板和100 ng HeLa总RNA起始量,将Maxima H Minus cDNA合成预混液与Thermo Scientific Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR以及其他品牌的预混液进行比较。以Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR作为对照,得到检测板中96个基因的ΔCt值(ΔCt = Maxima H Minus cDNA 合成预混液或其他市售产品的Ct – 用于RT-qPCR 的Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR的Ct)。

产品特点:

  • 在宽的RNA起始量范围内,RT-qPCR结果的一致性更高,cDNA合成效率更高
  • 方便的预混液形式,可降低移液差异
  • 包含用于RT-qPCR的dsDNase和no-RT对照,可控制RNA制备中的gDNA污染风险

 

技术细节:

  • 在96-基因检测板阵列中,cDNA合成效率始终较高
  • 在较宽的动态范围(1 pg-1 μg的总RNA)内,cDNA合成呈更高线性度
  • 在42°C-55°C的反转录过程中保持完整的酶活性

 

完整的cDNA合成工作流程解决方案

Maxima H Minus cDNA合成预混液具有双链特异性DNA酶(dsDNase),与传统DNase I相比,可更快、更高效和更完全地去除gDNA。dsDNase处理的RNA样品未显示出RNA完整性和数量的降低。在cDNA合成之前使用dsDNase处理,可最大限度降低使用传统DNase I净化样品带来的损失风险。

Maxima No-RT 对照混合物将与Maxima H Minus反转录酶预混液一起提供,从而为2步法RT-qPCR提供完整的cDNA合成解决方案。这种No-RT 对照混合物包含反转录预混液中除Maxima H Minus反转录酶以外的所有成分,使研究人员能够准确确定无残留的gDNA污染。

Maxima和Maxima H Minus反转录酶的分子改造

Thermo Scientific Maxima和Maxima H Minus反转录酶是利用体外分子改造技术而获得,该技术通过向传统M-MuLV反转录酶中引入多种突变,并从中筛选出能够改善cDNA合成性能的突变体.。改善的性能包括:

  • 更高的全长cDNA得率
  • 高反应温度,提高转录性能
  • 对长RNA模板的高转录效率
     

在广泛温度范围内的全长cDNA

在广泛的温度范围内,Maxima反转录酶优于其他反转录酶。它们对高反应温度的耐受性使其能够对具有广泛二级结构的RNA区域进行高效转录,并且有助于提高引物特异性,提高全长DNA的得率(图4)。

 

图4. 在广泛温度范围内的高cDNA得率。利用1 μg的Invitrogen Millennium RNA标记物(带有poly(A)-结构)和oligo(dT)18引物,使用Maxima H Minus反转录酶和来自其他供应商的反转录酶,按照说明书完成含有放射性标记cDNA合成,并进行对比。在碱性琼脂糖凝胶上分离反应产物。

长片断RT-PCR的扩增能力增强

Maxima H Minus反转录酶采用专利突变设计改善性能,能够从非常长的RNA模板合成全长cDNA(图5)。

 

图5. 对两步法RT-PCR中长靶标的扩增。使用Maxima H Minus反转录酶和来自其他供应商的反转录酶,根据产品说明书以哺乳动物细胞的总RNA(1ug)进行重复反转录反应。将所得cDNA产物作为模板进行PCR扩增,并在琼脂糖凝胶上进行分离和观察。仅Maxima H Minus反转录酶能够生成非常长(13.3kb)的产物,并且具有高得率。

RT-qPCR的理想选择-- 灵敏度高和可重复性定量

Maxima反转录酶能够在较宽的模板量范围内完成可重复的cDNA合成,使其成为RT-qPCR实验的理想选择(图6)。Thermo Scientific Maxima第一链cDNA合成试剂盒中的预混液有助于进一步改善重复性,并节省反应组装过程的时间。

 

图6. 在较宽的起始RNA量范围内,实现可重复的cDNA合成和低变异率(<1% SD/Ct)。在16个重复反应中,使用Maxima第一链cDNA合成试剂盒,以100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng哺乳动物细胞总RNA合成第一链cDNA。以合成的cDNA为模板,使用Themo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR预混液进行qPCR扩增。扩增曲线图说明,在起始用量范围内具有良好的一致性。

具有完整的gDNA去除步骤,工作流程简单

Maxima第一链cDNA试剂盒包括双链特异性DNA酶(dsDNase),能够在cDNA合成前清除基因组DNA,无需任何中间样品纯化步骤。经过改造的dsDNase能够在2分钟内去除污染的基因组DNA,并且不会损害RNA数量或质量,也不会降解引物和探针等单链DNA(图7)。温和的热处理(55℃)即可轻松使dsDNase失活。所得无基因组DNA的RNA样品可直接用于cDNA合成反应,大大简化了实验工作流程。

图7. 使用dsDNase有效去除基因组DNA。利用多种cDNA合成试剂盒,在有(RT +)和无(RT-)反转录酶的情况下对PBGD基因进行两步法RT-qPCR分析并绘图。使用具有dsDNase的Maxima第一链cDNA合成试剂盒或具有gDNA去除功能的其他供应商试剂盒,以0.2 ng总Jurkat RNA进行cDNA合成。使用Maxima试剂盒得到橙色、平坦的反转录反应曲线表明完全去除了污染的gDNA,而使用其他供应商试剂盒得到的反转录反应曲线显示具有残留gDNA的扩增。

在广泛的温度范围内能够有效保护RNA

RNA酶抑制剂通常会在高温条件下变性,释放RNA酶回到反应混合物中,随后损害和降解RNA。为了避免RNA被RNA酶破坏,所有Maxima第一链cDNA合成试剂盒均包含经改造的热稳定型Thermo Scientific RiboLock RNA酶抑制剂。蛋白质被“锁定”在RNA酶上,在高达55℃的温度下也能抑制RNA降解(图8)。RiboLock RNA酶抑制剂的高度热稳定性,对于在高反应温度下成功完成反转录至关重要。

图8. RiboLock RNA酶抑制剂可有效保护RNA并抑制高达2 ng/20 μL的RNA酶A。在37°C下,向人总RNA(1μg)分装样品(20 μL)中加入20 U的RiboLock RNA酶抑制剂,并提高RNase A的含量。
M:Thermo Scientific RiboRuler高分子量范围RNA Ladder,即用型
C:人总RNA
1:含RNAase A的人总RNA
2-5:含RiboLock RNA酶抑制剂和RNase A的人总RNA

RiboLock RNA酶抑制剂具有高度热稳定性。向人总RNA(1μg)分装样品(20 μL)中加入20 U的RiboLock RNA酶抑制剂和50 pg的RNase A,并在升高的温度下孵育。

 

了解分子进化

对聚合酶精细结构和功能的了解有限, 使我们使用合理的设计标准提高酶性能的想法受到了限制。通过模拟天然特性并使用定向进化来改善酶的性质,能够打破这种限制。

我们的专利技术——区室化核糖体展示(CRO)——能够实现快速、高效的反转录酶体外改进。该技术已经在野生型MMuLV反转录酶中引入和选择出多个有利突变,生成新型高度热稳定和高合成能力反转录酶,取代了相应的野生型反转录酶。

通过CRD技术进行分子改造包括几个步骤(图9)。首先,从野生型MMuLV反转录酶基因(1)开始,基于随机诱变创建mRNA文库(2)。接下来,在体外将mRNA文库翻译成与其mRNA前体相关的蛋白质(3)。然后,将蛋白质-mRNA复合物置于反转录酶反应混合物中并乳化,得到含有一个蛋白质-mRNA复合物的不同区室。最后,升高温度以产生选择性压力,在该选择压力下,只有改良突变体能够存活并产生全长cDNA(4)。通过结合性能最佳的突变,构建了高度进行性MMuLV RT突变体,其能够在高温下合成全长cDNA。

  1. Baranauskas A et al. (2012) Generation and characterization of new highly thermostable and processive M-MuLV reverse transcriptase variants. PEDS. doi:10.1093/protein/gzs034
  2. Skirgaila R et al. (2013) Compartmentalization of destabilized enzyme–mRNA–ribosome complexes generated by ribosome display: a novel tool for the directed evolution of enzymes. PEDS. doi:10.1093/protein/gzt017
     

图9. MmuLV反转录酶分子改造的关键步骤

Figure 10. Comparison of RTs and cDNA synthesis with or without functional RNase H activity.

在2步法RT-qPCR中高效完成反转录

我们全新的Thermo Scientific Maxima H Minus cDNA合成预混液可在2步法RT-qPCR中提供始终如一的高效和可重复的反转录。为了给您的cDNA合成带来最高价值,这种方便的单管式预混液配方中加入了一种工程化RNase H酶——Maxima H Minus反转录酶——其简单的方案可为您的RT-qPCR带来一致性,并实现最大控制。

为什么使用预混液?

  • 反应组装更方便
  • 有助于减少多个步骤带来的移液差异,提高RT-qPCR数据的准确性
  • 降低样品之间发生交叉污染的风险

为什么使用Maxima H Minus反转录酶?

  • 是通过分子改造得到的工程化MMuLV(莫洛尼鼠白血病病毒)反转录酶
  • 更高热稳定性
  • 更快合成速率
  • 持续合成能力提高50倍
  • 无RNase H活性
  • 已证明比竞争产品的灵敏度更高

在较宽的动态范围内具有高转录效率

Maxima H Minus cDNA合成预混液可在较宽的模板浓度范围内保持高转录效率和良好的线性(图1)。良好的线性表明,无论使用大量还是少量起始RNA,都能可靠代表不同转录物的相对数量。


图1. Maxima H Minus cDNA合成预混液的广泛动态范围。
标准曲线在宽的起始RNA范围内具有高度线性度(R2 = 0.999),这表明无论总RNA丰度是多少,特定RNA转录物的相对代表性在cDNA库中得以保留。将HeLa细胞总RNA进行10倍连续稀释(1 μg至0.1 pg),然后对人18S RNA基因进行扩增。使用Maxima H Minus cDNA合成预混液生成第一链cDNA。使用Thermo Scientific Luminaris Probe qPCR预混液(低ROX),在Applied Biosystems ViiA 7实时PCR系统上扩增cDNA。

 

一致的转录效率

在使用少量和大量起始RNA时,Maxima H Minus cDNA合成预混液都比其他品牌的反转录酶具有更高的效率(图2)。转录效率越高,RNA使用量越少,并且能够准确检测低表达的转录物。

图2. Maxima H Minus cDNA合成预混液的转录效率更强。在广泛的RNA起始量范围内,Maxima H Minus cDNA合成预混液比其他品牌的反转录酶具有更高的效率。将HeLa细胞总RNA进行10倍连续稀释(1 μg to 0.1 pg),然后对人18S RNA基因进行扩增。使用Maxima H Minus cDNA合成预混液、用于RT-qPCR 的Thermo Scientific Maxima第一链cDNA合成试剂盒以及来自其他四家供应商的反转录酶,生成第一链cDNA。使用Luminaris Probe qPCR预混液(低ROX),在ViiA 7实时PCR系统上扩增cDNA。扩增曲线表示ΔRn随循环数的变化。

对靶标阵列实现一致、可靠的转录

使用Maxima第一链cDNA合成试剂盒得到的RT-qPCR数据进行归一化处理后发现,在RT-qPCR中96个靶基因中,Maxima H Minus cDNA合成预混液始终比其他供应商的反转录酶预混液具有更高的效率(图3)。

图3. Ct值一致降低。在广泛的靶标范围内,Maxima H Minus cDNA合成预混液比其他市售预混液具有更高的cDNA合成效率。使用96基因Applied Biosystems TaqMan®检测板和100 ng HeLa总RNA起始量,将Maxima H Minus cDNA合成预混液与Thermo Scientific Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR以及其他品牌的预混液进行比较。以Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR作为对照,得到检测板中96个基因的ΔCt值(ΔCt = Maxima H Minus cDNA 合成预混液或其他市售产品的Ct – 用于RT-qPCR 的Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR的Ct)。

产品特点:

  • 在宽的RNA起始量范围内,RT-qPCR结果的一致性更高,cDNA合成效率更高
  • 方便的预混液形式,可降低移液差异
  • 包含用于RT-qPCR的dsDNase和no-RT对照,可控制RNA制备中的gDNA污染风险

 

技术细节:

  • 在96-基因检测板阵列中,cDNA合成效率始终较高
  • 在较宽的动态范围(1 pg-1 μg的总RNA)内,cDNA合成呈更高线性度
  • 在42°C-55°C的反转录过程中保持完整的酶活性

 

完整的cDNA合成工作流程解决方案

Maxima H Minus cDNA合成预混液具有双链特异性DNA酶(dsDNase),与传统DNase I相比,可更快、更高效和更完全地去除gDNA。dsDNase处理的RNA样品未显示出RNA完整性和数量的降低。在cDNA合成之前使用dsDNase处理,可最大限度降低使用传统DNase I净化样品带来的损失风险。

Maxima No-RT 对照混合物将与Maxima H Minus反转录酶预混液一起提供,从而为2步法RT-qPCR提供完整的cDNA合成解决方案。这种No-RT 对照混合物包含反转录预混液中除Maxima H Minus反转录酶以外的所有成分,使研究人员能够准确确定无残留的gDNA污染。

Maxima和Maxima H Minus反转录酶的分子改造

Thermo Scientific Maxima和Maxima H Minus反转录酶是利用体外分子改造技术而获得,该技术通过向传统M-MuLV反转录酶中引入多种突变,并从中筛选出能够改善cDNA合成性能的突变体.。改善的性能包括:

  • 更高的全长cDNA得率
  • 高反应温度,提高转录性能
  • 对长RNA模板的高转录效率
     

在广泛温度范围内的全长cDNA

在广泛的温度范围内,Maxima反转录酶优于其他反转录酶。它们对高反应温度的耐受性使其能够对具有广泛二级结构的RNA区域进行高效转录,并且有助于提高引物特异性,提高全长DNA的得率(图4)。

 

图4. 在广泛温度范围内的高cDNA得率。利用1 μg的Invitrogen Millennium RNA标记物(带有poly(A)-结构)和oligo(dT)18引物,使用Maxima H Minus反转录酶和来自其他供应商的反转录酶,按照说明书完成含有放射性标记cDNA合成,并进行对比。在碱性琼脂糖凝胶上分离反应产物。

长片断RT-PCR的扩增能力增强

Maxima H Minus反转录酶采用专利突变设计改善性能,能够从非常长的RNA模板合成全长cDNA(图5)。

 

图5. 对两步法RT-PCR中长靶标的扩增。使用Maxima H Minus反转录酶和来自其他供应商的反转录酶,根据产品说明书以哺乳动物细胞的总RNA(1ug)进行重复反转录反应。将所得cDNA产物作为模板进行PCR扩增,并在琼脂糖凝胶上进行分离和观察。仅Maxima H Minus反转录酶能够生成非常长(13.3kb)的产物,并且具有高得率。

RT-qPCR的理想选择-- 灵敏度高和可重复性定量

Maxima反转录酶能够在较宽的模板量范围内完成可重复的cDNA合成,使其成为RT-qPCR实验的理想选择(图6)。Thermo Scientific Maxima第一链cDNA合成试剂盒中的预混液有助于进一步改善重复性,并节省反应组装过程的时间。

 

图6. 在较宽的起始RNA量范围内,实现可重复的cDNA合成和低变异率(<1% SD/Ct)。在16个重复反应中,使用Maxima第一链cDNA合成试剂盒,以100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng哺乳动物细胞总RNA合成第一链cDNA。以合成的cDNA为模板,使用Themo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR预混液进行qPCR扩增。扩增曲线图说明,在起始用量范围内具有良好的一致性。

具有完整的gDNA去除步骤,工作流程简单

Maxima第一链cDNA试剂盒包括双链特异性DNA酶(dsDNase),能够在cDNA合成前清除基因组DNA,无需任何中间样品纯化步骤。经过改造的dsDNase能够在2分钟内去除污染的基因组DNA,并且不会损害RNA数量或质量,也不会降解引物和探针等单链DNA(图7)。温和的热处理(55℃)即可轻松使dsDNase失活。所得无基因组DNA的RNA样品可直接用于cDNA合成反应,大大简化了实验工作流程。

图7. 使用dsDNase有效去除基因组DNA。利用多种cDNA合成试剂盒,在有(RT +)和无(RT-)反转录酶的情况下对PBGD基因进行两步法RT-qPCR分析并绘图。使用具有dsDNase的Maxima第一链cDNA合成试剂盒或具有gDNA去除功能的其他供应商试剂盒,以0.2 ng总Jurkat RNA进行cDNA合成。使用Maxima试剂盒得到橙色、平坦的反转录反应曲线表明完全去除了污染的gDNA,而使用其他供应商试剂盒得到的反转录反应曲线显示具有残留gDNA的扩增。

在广泛的温度范围内能够有效保护RNA

RNA酶抑制剂通常会在高温条件下变性,释放RNA酶回到反应混合物中,随后损害和降解RNA。为了避免RNA被RNA酶破坏,所有Maxima第一链cDNA合成试剂盒均包含经改造的热稳定型Thermo Scientific RiboLock RNA酶抑制剂。蛋白质被“锁定”在RNA酶上,在高达55℃的温度下也能抑制RNA降解(图8)。RiboLock RNA酶抑制剂的高度热稳定性,对于在高反应温度下成功完成反转录至关重要。

图8. RiboLock RNA酶抑制剂可有效保护RNA并抑制高达2 ng/20 μL的RNA酶A。在37°C下,向人总RNA(1μg)分装样品(20 μL)中加入20 U的RiboLock RNA酶抑制剂,并提高RNase A的含量。
M:Thermo Scientific RiboRuler高分子量范围RNA Ladder,即用型
C:人总RNA
1:含RNAase A的人总RNA
2-5:含RiboLock RNA酶抑制剂和RNase A的人总RNA

RiboLock RNA酶抑制剂具有高度热稳定性。向人总RNA(1μg)分装样品(20 μL)中加入20 U的RiboLock RNA酶抑制剂和50 pg的RNase A,并在升高的温度下孵育。

 

了解分子进化

对聚合酶精细结构和功能的了解有限, 使我们使用合理的设计标准提高酶性能的想法受到了限制。通过模拟天然特性并使用定向进化来改善酶的性质,能够打破这种限制。

我们的专利技术——区室化核糖体展示(CRO)——能够实现快速、高效的反转录酶体外改进。该技术已经在野生型MMuLV反转录酶中引入和选择出多个有利突变,生成新型高度热稳定和高合成能力反转录酶,取代了相应的野生型反转录酶。

通过CRD技术进行分子改造包括几个步骤(图9)。首先,从野生型MMuLV反转录酶基因(1)开始,基于随机诱变创建mRNA文库(2)。接下来,在体外将mRNA文库翻译成与其mRNA前体相关的蛋白质(3)。然后,将蛋白质-mRNA复合物置于反转录酶反应混合物中并乳化,得到含有一个蛋白质-mRNA复合物的不同区室。最后,升高温度以产生选择性压力,在该选择压力下,只有改良突变体能够存活并产生全长cDNA(4)。通过结合性能最佳的突变,构建了高度进行性MMuLV RT突变体,其能够在高温下合成全长cDNA。

  1. Baranauskas A et al. (2012) Generation and characterization of new highly thermostable and processive M-MuLV reverse transcriptase variants. PEDS. doi:10.1093/protein/gzs034
  2. Skirgaila R et al. (2013) Compartmentalization of destabilized enzyme–mRNA–ribosome complexes generated by ribosome display: a novel tool for the directed evolution of enzymes. PEDS. doi:10.1093/protein/gzt017
     

图9. MmuLV反转录酶分子改造的关键步骤

Figure 10. Comparison of RTs and cDNA synthesis with or without functional RNase H activity.

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