Phusion DNA 聚合酶

自推出以来,Thermo Scientific Phusion高保真 DNA 聚合酶已被数千份文献引用,业已成为一系列高要求实验应用的首选,涵盖全基因组的重构、设计和大规模并行高通量测序。Phusion产品系列包括12种规格,即便对于一些特殊实验应用仍可实现高保真PCR扩增。

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为何要选用 Phusion 高保真 DNA 聚合酶?

Phusion高保真DNA聚合酶由一个DNA结合域融合到一个Pyrococcus-like校正聚合酶构成。正是由于这一独特的功能配对,Phusion DNA聚合酶可以以超高的精确度和超快的扩增速度生成 PCR 产物。此外,Phusion DNA聚合酶还可耐受不同的抑制剂,几乎无需优化,即可稳定扩增 PCR 产物。

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技术特征

  • 高保真——准确度比Taq超出52倍,比Pfu超出6倍
  • 更高的可靠性——减少反应失败几率,最大限度避免反应优化需要
  • 产量更高——以最小的酶用量(0.5–1 U/50 μL 反应)实现较高的产品得率
  • 高速—更高的合成能力,缩短反应时间(延伸速度 15–30 s/kb)
  • 更高的特异性——独特的热启动技术,无需再次活化时间,减少了非特异性扩增和引物降解
  • 简化的实验流程——Phusion绿色DNA聚合酶可以直接将PCR产物上样到凝胶上进行电泳

客户案例

"当我们发现自己只需大约原来四分之一的时间就能够完成同样数量的循环扩增后(单位成本仅有些许上涨),我们毅然决然地选择了Phusion。"

——Matt W. Ford,美国爱达荷州立大学生物科学系博士生。

"我们测试了不同的热稳定性 DNA 聚合酶,但只有 Phusion 酶(一种类热球菌(Pyrococcus) DNA 聚合酶,可以融合双链 DNA 结合域)具有强劲的持续合成能力"

——Hass M et al.(2008) J. Virol.82:10207-10217.

"最初试用 Turbo-Pfu 聚合酶时并不成功。但在换用具有高持续合成能力的 Phusion 聚合酶后,使用载体 pHWSccdB 时即获得了阳性克隆。"

——Stech J et al.(2008)
Nucleic Acids Research, 36:e139.


Phusion DNA 聚合酶特性

在诸如克隆、定点突变、将DNA片段翻译为蛋白质等多种应用中,非常关键的一点是如何在扩增过程中保持精确的DNA序列。一个错误结合的核苷酸就可能改变相应的编码子,并导致在翻译过程中结合错误的氨基酸。这就会进一步影响到蛋白质的折叠和功能特性。另一方面,缺失一个核苷酸就会彻底破坏正确的阅读框。

Phusion DNA聚合酶具有极低的错配率,因而成为了克隆、亚克隆、NGS样品制备以及定点突变等高保真PCR应用的理想选择。使用改良的 lacI 方法 [1]检测,Phusion DNA聚合酶的错配率比Taq DNA聚合酶低约50倍, 比Pfu DNA聚合酶低6倍(见图 1)。

图 1:柱状图显示了Phusion DNA聚合酶和其他厂商的保真聚合酶的相对保真值,实验结果采用改良的lacI方法[1]获得,参照标的为Taq的保真度。本例中的Taq保真度为1x。

参考文献

1.B.F.Frey & B. Suppmann (1995) Demonstration of the Expand PCR System's greater fidelity and higher yields with a lacI-based fidelity assay. Biochemica 2, 34-35.

由于自身独特的结构,Phusion DNA聚合酶还具有很高的效率。相对于常规的聚合酶,使用Phusion DNA聚合酶进行任何PCR反应所需的酶量都要少得多。高速和高效率意味着您的PCR反应产量更高、特异性非常高。此外,此类聚合酶高度稳定,可以最大限度避免反应条件的优化。相对于同类高保真聚合酶,Phusion Hot Start II DNA聚合酶表现出了更高的PCR灵敏度,可以特异性扩增来自人类基因组DNA的靶标片段(图 2)

高度灵敏、特异的PCR扩增

图2:高度灵敏、特异的PCR扩增。分别采用Phusion Hot Start II绿色预混液(A)和来自其他厂商的热启动 DNA 聚合酶(B)Merck KOD Hot Start,(C)Agilent Pfu Ultra II HS,(D)KAPA Biosystems KAPA HiFi HS以及(E)Takara PrimeSTAR MAX 扩增来自于人类基因组DNA的2kb片段。Phusion Hot Start II DNA聚合酶获得了高产量的特异性产物,而其他酶要么无产物,要么产物产量很低,部分甚至扩增出了非特异性产物。

与其他聚合酶相比,Phusion DNA聚合酶在每次结合反应中都能够引入更多的核苷酸。这种高持续合成处理能力大大缩短了延伸步骤的时间,进而加快了整个反应的进行。使用专为快速PCR开发的Thermo Scientific Phusion Flash高保真PCR预混液,可实现快速实验方案。Phusion Flash 高保真 PCR 预混液超过竞品,获得了特异性产物,延伸时间低至 10s/kb (图 3)

图3:Phusion Flash高保真PCR预混液可提供极快的扩增速度及高得率。根据厂商的建议,分别采用(A) Phusion Flash 高保真 PCR 预混液和其他厂商的聚合酶(包括(B) Agilent Pfu Ultra II Fusion 和 (C) Qiagen Fast Cycling 2X Mix),使用不同的延伸时间(10-60 秒)扩增 1.5 kb长的人cathepsin K基因。仅 Phusion Flash 高保真 PCR 预混液能够在 10-20 秒超短延伸时间内扩增 1.5 kb 基因。相对于其他测试聚合酶,其还实现了更高的特异性产物得率。

选择最合适的Phusion DNA聚合酶产品

Phusion高保真DNA聚合酶提供了各种规格,即便对于一些特殊应用仍可实现高保真PCR扩增。Phusion高保真DNA聚合酶具有超高的保真度、更好的热稳定性、可靠性,同时对PCR中的抑制剂具有较高的耐受性。您可通过下表为您的实验应用查找合适的Phusion产品。

产品 描述 应用 规格

Thermo Scientific Phusion 高保真DNA聚合酶

具有高准确度、稳定反应性能及高抑制剂耐受性的 热稳定性DNA 聚合酶。
  • 高保真PCR
  • 长片段PCR
Thermo Scientific Phusion 高保真PCR预混液(含GC 缓冲液) 经特殊优化的高保真PCR预混液提供HF和GC两种形式缓冲液,HF用于获取最高保真度,GC用于富含GC模板的扩增。
  • 高保真PCR
  • 扩增困难(富含 GC)模板
  • 长片段PCR
Thermo Scientific Phusion Flash 高保真PCR预混液 PCR预混液使您可在确保反应保真度和产量的前提下,进行时间超短的 PCR 实验方案。
  • 快速PCR
  • 高保真PCR
  • 长片段PCR

Thermo Scientific Phusion 热启动 II DNA聚合酶和 PCR 预混液 

可改善PCR特异性和稳定性的单酶和预混液
  • 热启动PCR
  • 高通量PCR
  • 高保真PCR
  • 长片段PCR
Thermo Scientific Phusion 定点突变试剂盒 在任意类型的质粒DNA中引入点突变、缺失突变的多功能、高效工具。
  • 突变
hermo Scientific Phusion U 热启动DNA聚合酶和 PCR 预混液 用于高保真地扩增含尿嘧啶模板及引入 dUTP的单酶和PCR预混液。Phusion U DNA聚合酶含独有的dUTP结合域突变,可耐受PCR扩增期间的尿嘧啶和引入dUTP。
  • 扩增亚硫酸盐转化的DNA
  • 扩增损伤或老化的 DNA
  • 残余污染控制
  • 基于Uracil-excision (USER) 的克隆方法
Thermo Scientific Phusion U 多重PCR预混液 高性能多重PCR预混液,可以同时扩增多达20个长达2.5 kb的靶标。该预混液基于Phusion U热启动 DNA聚合酶,可确保获得高产量的特异性产物。
  • 多重PCR
Thermo Scientific Phusion 缓冲液 单独的不含清洁剂的 Phusion HF和GC缓冲液。不含去垢剂版本建议用于 DHPLC和微阵列等实验应用。
  • 高保真PCR
  • 扩增困难(富含 GC)模板
  • DHPLC和微阵列应用

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