选择二抗

我们提供种类齐全的Invitrogen™二抗以供选择,包括Invitrogen™ Alexa Fluor™荧光标记HRP标记,以及其它类型标记物的二抗,适用于广泛的宿主和目标种属。因为不同的二抗应用对特异性、灵敏度以及标记物的需求不同,我们提供的丰富选择可以帮助研究者优化实验,获得理想的实验结果。

什么是二抗?

二抗是指用于靶向结合一抗的抗体。在多种免疫印迹、ELISA以及免疫荧光等免疫实验中,二抗经常和一抗结合使用以检测目标蛋白。很多二抗都带有标记物,例如Alexa Fluor荧光染料或辣根过氧化物酶(HRP),从而使二抗的信号可以被检测到。

实验中也可以使用带有标记物的一抗,但是二抗有很多优点。无论是使用哪种一抗进行检测,使用二抗可便于更换不同的标记物。例如,同样的一抗可以与HRP标记二抗一起用于免疫印迹,也可以与另一种Alexa Fluor 488荧光标记二抗一起用于免疫荧光实验。

另外,二抗结合在抗原位置的标记染料比直标一抗要多,从而增强检测信号。使用二抗可以避免对一抗进行复杂且昂贵的化学标记(偶联),而且偶联反应(具有氨基酸特异性)可能干扰一抗对抗原的识别。

选择最合适的二抗

要选择出一种最适用于您的应用和研究的最佳二抗,建议考虑以下因素:

  • 种属来源和种属反应性
  • 特异性反应
  • 纯化方法
  • 交叉吸附
  • 多重检测能力
  • 抗体类型和亚型
  • 完整抗体还是抗体片段
  • 标记物
  • 生物素结合蛋白

应用类型、一抗种类以及实验设计通常会决定所需的二抗类型。请使用我们的抗体搜索工具来找到您所需要的二抗产品。如果需要详细了解关于选择二抗时需要考虑的因素,请阅读下文内容。

种属来源是指制备这种二抗的物种。例如,当使用兔IgG免疫山羊时,获得的抗体是山羊抗兔二抗。我们提供的种属来源包括鸡、驴、山羊、小鼠、兔、大鼠以及绵羊。

注意,所用二抗的种属来源必须不同于一抗的种属来源和反应种属。例如,如果一种一抗来源于兔,则不能使用来源于兔的二抗。

大多数一抗是在小鼠或兔的体内制备的;抗鼠IgG和抗兔IgG二抗是最畅销的类型。山羊是最容易且最经常被制造商选用的二抗种属来源,用来制备多克隆抗鼠和抗兔的二抗。因此,山羊来源的抗鼠IgG和抗兔IgG二抗是形式最广泛的商业化二抗。市面上也有一些来源于其它物种的抗鼠和抗兔二抗。

下一步,确保二抗可以检测相应的目标一抗。反应性不仅包括目标物种,还包括目标免疫球蛋白(Ig)的类型和亚型,以及该二抗是否和抗体的特定部分结合(见下文)。

确定所需目标物种的方法通常简单直接,它指的是一抗的种属来源。如果使用的是兔源多克隆一抗,则需要使用抗兔二抗。如果想要检测鼠源抗体,则需要使用抗鼠二抗。我们提供针对17种不同目标物种的二抗。

大多数二抗从经过免疫的动物血清纯化获得。亲和纯化是指将含有抗体的血清通过固相配体的多孔纯化树脂柱。亲和配体会与抗体互相结合,之后血清中其他未结合的成分可经过漂洗步骤去除,最后使用一种可破坏配体-抗体相互作用的缓冲液将抗体从树脂柱上洗脱并回收(即纯化抗体)。这种类型的纯化方法是通过使用可识别抗体的配体(如蛋白G)或可被抗体识别的配体(如目标抗原)来实现的。

使用蛋白G作为亲和配体可纯化血清中的所有抗体(主要是IgG),而不区分其抗原特异性。使用目标抗原作为亲和配体仅纯化血清中的抗原特异性抗体(任意亚型的免疫球蛋白)。

对二抗进行交叉吸附可以帮助去除来源于非目标抗体和蛋白的交叉反应性,从而提高抗体的特异性。交叉吸附是指将亲和纯化的二抗通过一个固定有其它种属来源的抗体或血清蛋白的纯化柱。能够识别这些其它种属来源的抗体或血清蛋白的二抗将结合在纯化柱上,通过这种方法可以获得交叉反应性更低的二抗,从而降低背景和提升抗体效价。

如果想进一步避免交叉反应性,请尝试Invitrogen™ Superclonal™重组二抗。Superclonal重组二抗代表着重组抗体技术的突破性进展。通过我们的专利筛选和生产工艺制备的二抗是特定重组山羊或兔抗的混合物,会同时具备单克隆抗体特异性识别单一抗原表位的精准性,以及多克隆抗体识别同一抗原的多个表位的灵敏度。

下面是使用经过交叉吸附处理的二抗的示例,所用二抗为Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠IgG二抗 (货号 A11029)。该二抗经过与牛、山羊、兔、大鼠和人IgG以及人血清的交叉吸附处理。结果显示了极低的交叉反应性和背景信号。

图1. BPAE(牛肺动脉内皮)细胞使用Image-iT 固定/通透试剂盒(货号R37602),使用抗β-微管蛋白抗体标记,并使用Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠二抗(货号A11029)和Click-iT EdU Alexa Fluor 647(货号C10340)二抗进行染色。图像使用Nikon正置显微镜(60X)拍摄。

对于很多抗体检测[RG1]应用而言,可选择进行多重检测。多重检测是指使用不同的荧光染料同时检测多种目标蛋白。高度交叉吸附纯化的抗体降低了物种间交叉反应性和背景信号,可以很好的实现多重检测。选择标记物时需要注意选择发射光谱不重叠的标记物。

下面是使用Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG二抗(货号A11034),DAPI,以及Alexa Fluor 594标记的鬼笔环肽进行多重检测的示例。

图2. Visfatin ABfinity™重组兔单克隆抗体对Hela细胞染色的免疫细胞化学分析。 (A) 使用Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG二抗(货号A11034,绿色)检测一抗; (B) 使用DAPI进行核染色(蓝色)。使用Alexa Fluor 594标记的鬼笔环肽对actin蛋白进行染色(红色)。(C) 显示出visfatin蛋白的细胞质和细胞核定位的组合图。

抗体有几种不同的类型,每种类型在正常的免疫系统内都有特定的功能。我们目前提供针对IgG、IgM、IgA、IgE和IgD的二抗。这些抗体都含有独特的重链,分别是γ、μ、α、ε和δ。 IgA和IgM还包含一个额外的15 kDa J链,后者通过二硫键和抗体结合并可帮助形成功能性的多价抗体。IgG可进一步根据氨基酸组成的不同分为不同亚型——IgG1、IgG2等。

选择二抗时很重要的一点是选择特异性针对所用一抗类型或亚型的二抗。当使用的是单克隆一抗时这一点尤为重要,因为根据定义,每种单克隆抗体仅属于一种抗体亚型。

二抗分为完整抗体形式和抗体片段形式。使用完整抗体还是抗体片段通常取决于所进行的应用。例如,抗体片段对于免疫组织化学和免疫荧光是最佳选择,因为它们的分子量较小并易于穿透组织。在其它大多数应用中,完整抗体是最常用的二抗类型。

完整的抗体包括重链和轻链,通过可变区提供二价结合能力,同时具有可偶联产生信号的染料或酶标记物的的恒定区。但是,完整抗体可能会导致高背景和低特异性,因为所有免疫球蛋白的轻链区是相同的,从而增加了交叉反应性。

F(ab’)2片段是通过对完整抗体使用胃蛋白酶进行酶解后获得的。这种抗体片段包含带有两个抗原结合位点的可变区,但缺少抗体的Fc片段。因此,F(ab’)2片段对于可能含有Fc受体的样本而言是应当优先选择的二抗类型。同时它们比完整抗体要小,因此穿透某些样本的效果更好。但是,分子较小也意味着可以同F(ab’)2片段偶联的染料和酶也更少,从而使得这类二抗的灵敏度不及完整抗体形式的二抗。Fab’片段是通过对完整抗体使用木瓜蛋白酶进行酶解后获得的。这类抗体片段包含一个单独的结合结构域,同时带有一小部分恒定区。Fab’片段可以用于不适合使用二价抗体的一些特定应用。

图3. 抗体片段的名称和结构。

如需了解更多信息,请浏览我们的抗体片段化网页

标记物的选择取决于所进行的应用以及如何检测二抗。这是一个需要Alexa Fluor荧光染料的高亮度和光稳定性的细胞成像实验吗?需要使用高活性HRP标记物并通过化学发光底物进行灵敏的免疫印迹检测吗?下面是对于我们提供的每种类型的二抗标记物的介绍。

  • Alexa Fluor 标记物:我们提供18种不同的Alexa Fluor染料作为二抗标记物。Alexa Fluor二抗具有卓越的光强度和光稳定性,性能优于传统的荧光二抗。Alexa Fluor标记物有超过50,000篇的文献引用,塑造了过去二十年来的荧光成像技术进程。如需了解更多详情,请浏览Alexa Fluor染料Alexa Fluor 488页面。
  • Alexa Fluor串联标记物:我们提供多种用于流式细胞技术的链霉亲和素-藻红蛋白(RPE)和别藻蓝蛋白(APC)与Alexa Fluor染料的串联标记物。RPE的Alexa Fluor标记物比传统的RPE荧光染料信号更强,可获得更高的检测灵敏度,捕获丰度更低的细胞信号。
  • 其它优质荧光标记物:这些年来我们开发了多种Molecular Probes™荧光染料。这些专业染料为寻找荧光染料的用户提供了丰富的选择。例如,BODIPY™ FL染料具有独特的疏水特性以及相对较长的激发态寿命。Oregon Green™染料,pKa值为4.6,可以用于检测pH值的变化。Cascade Blue™染料与绿色荧光染料的光谱重叠较小。
  • Pacific标记物:我们提供适用于流式细胞仪405 nm激光检测的Pacific染料。Pacific Blue™Pacific Green™Pacific Orange™染料可同时在405 nm被激发,而分别在455 nm, 500 nm, 和551 nm具发射峰,便于进行三色分析。这些染料的标记物即使在中性pH值也具有强荧光。
  • Qdot™标记物:Qdot标记的二抗的光强很高——相当于有机染料光强的50倍——并且它们完全不会发生光漂白。因为所有Qdot探针都可以使用相同波长激发,但是发射峰值不同,因此可以同时检测所有的8种颜色。
  • 经典荧光标记物:荧光素 (FITC)、 四甲基若丹明 (TRITC)、Cy3Cy5以及Texas Red™等经典荧光染料,现在都可使用Alexa Fluor染料进行替代,以获得更好的光强度和光稳定性。但是,我们仍然提供上述标记物偶联的二抗以方便用户重复以前的实验。另外,这些染料在某些应用中可能特别适用,例如利用荧光素的高光漂白率和pH敏感性。
  • 经典荧光串联标记物:大多数早期的串联染料,如RPE, Texas Red染料,RPE–Cy5(我们使用商标名TRI-COLOR™出售),以及RPE–Cy5.5,现在都可使用Alexa Fluor染料进行替代,以获得更好的性能。但是,我们仍然提供上述标记物偶联的二抗以方便用户重复以前的实验。这些标记物经常应用于多色流式细胞技术实验。
  • R-PhycoerythrinAllophycocyanin:我们提供R-藻红蛋白和别藻蓝蛋白染料偶联的二抗。R-藻红蛋白 (RPE)和别藻蓝蛋白 (APC)是高强度藻胆蛋白,提纯自红藻,具有极高的荧光强度和量子产出。这些基于大分子蛋白的荧光分子主要用于流式细胞检测、基因芯片、ELISA,以及其它需要高灵敏度而非光稳定性的应用。
  • 酶标记物:我们提供高活性的辣根过氧化酶(HRP)碱性磷酸酶(AP)二抗标记物,以用于western blot、ELISA、免疫组织化学或其它酶催化的应用。酶标记物需要与能显色、产生荧光或进行化学发光的底物结合使用以获取可检测的信号。因为一个分子的酶可以催化许多分子的底物,因此这种形式的信号放大可以通过反应进行的时间长度来控制。
  • 生物素标记物:我们提供多种生物素和DSB生物素标记物。生物素是一个小分子,一种半抗原,可以和亲和素、链霉亲和素或NeutrAvidin™ 蛋白结合。使用生物素标记的二抗使研究者可以在多个应用中使用相同的二抗,只需改变所用的链霉亲和素标记物即可。使用生物素/链霉亲和素体系还可以提高信号。一个荧光二抗通常有5个染料分子与其偶联,而在生物素/链霉亲和素体系中,二抗可能含有5个生物素分子,每个生物素和1个链霉亲和素分子结合,而每个链霉亲和素含有5分子染料。但是,内源生物素可能会在富含生物素的样本中造成高背景。因此它并非是每种应用的最佳体系。
  • Gold标记物:我们可为应用电子显微镜检测技术的用户提供金标记物二抗。我们还可提供同时带有Alexa Fluor染料和Gold标记的二抗,以用于免疫荧光相关的荧光分析和电子显微镜应用。
  • 琼脂糖Sepharose™树脂标记物:二抗可以用于抗体纯化。将二抗结合在纯化柱基质上后,例如珠状琼脂糖(Sepharose是珠状琼脂糖的一个品牌名称),通过抗体与二抗的特异性结合进行纯化。
  • 未标记二抗:除了多种标记二抗,我们也提供未标记的二抗。这些二抗与我们用来制备标记二抗的产品品质同样可靠。

对于将一抗使用生物素标签标记的应用,生物素结合蛋白成为合适的检测试剂。亲和素和链霉亲和素都可与生物素高强度结合,这使得同一种检测试剂可以用于检测多种一抗而不考虑其宿主物种。

除了抗体,很多其它蛋白也可使用生物素标记并作为一级探针,可以用亲和素或链霉亲和素作为二级探针与其一起使用。如果某种一抗市场上没有使用生物素标记的形式,那么可以使用我们的EZ-Link™生物素标记试剂或试剂盒对其进行标记。

我们提供3种不同种类的生物素结合蛋白,请参见下表对它们的描述。

生物素结合蛋白比较

  亲和素 链霉亲和素 NeutrAvidin™蛋白
分子量 67 kDa 53 kDa 60 kDa
生物素结合位点 4 4 4
等电点(pI) 10 6.8 to 7.5 6.3
特异性 最高
生物素亲和性 (Kd) 10-15 M 10-15 M 10-15 M
非特异性结合 最低

技术资源

二抗
Alexa Fluor标记物
用于Western Blotting的抗体

Molecular Probes手册
BioProbes细胞生物学应用期刊
二抗(根据目标种属分类)