microscope stage with a cell culture dish

实时观察生物过程

细胞学研究是最基础的生物学研究,活细胞是科学家研究生物过程最为方便的模型之一。不过在各种实验操作和成像条件下,想保持细胞的健康和活力并不是一件容易的事。

下述信息将帮助您判断是否需要在研究中开展活细胞成像实验。


本节主题


使用活细胞开展成像实验

  • 细胞酶类及其他胞浆分子仍存在于胞内
  • 能够观察它们之间发生的动态细胞学过程
  • 能够在其天然环境中研究细胞学结构,减少实验影响假象
  • 可实时追踪细胞生物分子与结构(变化)
  • 可观察细胞间的相互作用

  • 细胞需保持在天然的生理条件范围内,包括酸度、温度和渗透压
  • 须通过特定方法来标记靶标——无论是对于一个分子、细胞功能还是细胞状态——以最小的细胞毒性来检测
  • 活细胞一般不允许大分子(即抗体)通过
  • 移动的目标比较难于聚焦
  • 检测技术对活细胞有损伤

活细胞成像让你有机会观察活跃的生物学过程

使用延时成像技术开展活细胞研究通常简称为“活细胞成像”。延时成像照片之间的时间间隔可以是从微秒到数天之内的任何时间长度,这一时间间隔的确定主要基于需要在实验中观察的生物学过程。通过活细胞成像技术,您可以研究靶标参与的动态生命过程,这一观察与固定细胞成像具有显著差异,后者的细胞结构被冻结在一个时间点,细胞活动处于停止状态。有了活细胞成像技术,酶活性、信号转导、蛋白与受体转运以及膜的再循环过程(内吞与胞吐)等动态进程都可实现检测。

video showing contractions in mouse cardiomyocytes

图 1. 小鼠胚胎干细胞来源心肌细胞的自发收缩,通过CellLight®肌动蛋白-GFP进行观察。

HeLa cells undergoing mitotic division during live cell fluorescent imaging in red and green channels

图 2. 在HeLa细胞中通过活细胞荧光成像(红色与绿色通道)捕捉线粒体分裂过程,通过CellLight® Histone2B-GFP与线粒体-RFP来进行标记。


在实验过程中保持细胞存活需要认真的实验计划和小心的操作

为了研究活动的生命进程,您将需要建立细胞培养条件,并在显微镜下维持细胞的健康与活性,您需要尽量设计非侵入性的实验,因为荧光成像过程中的照射可能对细胞具有不良的副作用,这一点不同于在细胞培养箱中孵育的细胞。活细胞成像需要您在实验过程中保持细胞功能性的同时,评估实验方法中是否存在着导致结果难于解释的问题。


在开始活细胞成像实验前需要考虑的关键因素

当您计划开展一项活细胞成像实验,很有必要制定一个实验计划,并在其中包含以下重要的考虑事项。


光照与检测

通常情况下最好使用尽可能弱的光线对活细胞样本进行成像,以避免光毒性的不良影响。这意味着您需要选择能够最大程度地控制光源的成像系统,这样就能够将波长范围以及细胞成像用光子数减至最小,应尽可能在最低水平的荧光基团激发条件下,获取尽可能高的目的信号。当出于避免光毒性的目的限制光强时,光信号可能会降低,因此需要一套包含灵敏检测器的活细胞成像系统(冷却型CCD摄像机是一个理想选择)。长时程活细胞成像可能并不容易实现,因为靶标可能随着时间推移而移出成像焦点。许多显微镜具有自动聚焦功能,从而可帮助克服这一问题。此外,维持稳定的系统温度,保持成像器皿中的溶液体积都将有助于解决焦点漂移的问题。


标记

可使用 荧光蛋白 来标记您所感兴趣的蛋白或细胞结构,目前存在着各类候选荧光蛋白可以方便和强大地胜任这一标记工作。

对于某些生物学问题而言,较小的膜通透性试剂可能是您的最佳选择。从激发的角度来说,这类试剂所包含的荧光基团通常仅在结合了某一特定离子(如钙离子)之后才会显著发光。通过选择最为明亮和特异性的荧光基团,就可在相对较低的浓度下,仍获得对靶标的有效观察信号。通常还可以对条件进行优化,这样就可使用最低剂量的光线来激发荧光素,进而在 低背景条件下获得良好的信号,这意味着需要尽可能优化实验条件,以使用最低的照明强度和最短的曝光时间。在某些情况下,特别是开展长时程成像时,推荐牺牲些许分辨率来换取更健康的细胞,这意味着缩短 曝光时间, 执行像素合并或使用更低的放大倍数。如果可能,也可选择靠近荧光光谱红色一端的探针,这些探针的激发波长更长,而长波长的光线光毒性更小。


环境控制

许多细胞无法忍受温度、渗透压、酸度和湿度的显著偏差。当然,实验需求是不断变化的,这主要基于您希望回答的科学问题。举例来说,研究细胞生长与分裂的实验可能与研究受体激活和钙聚集等实验具有(明显)不同的需求。一些强大的永生化细胞系能够在无任何环境控制的条件下忍受短时间成像;另一方面,对于长时程成像研究而言,如需获得永生细胞和原代细胞的良好观察结果,通常都要严格控制环境参数。

在短时程成像实验中,可使用较大的培养基体积来避免由于挥发所导致的渗透压和含氧量方面的问题;对于长时程研究而言,一般使用加热单元与加湿-CO2控制孵育箱的组合来控制温度、酸度和湿度,成像培养基中还需加入基于碳酸氢盐的缓冲系统。

 
成像培养基

目前有一些可用于成像实验的专用培养基。一个选择是可使用细胞培养过程中所使用的相同培养基来开展成像实验,大多数细胞培养基配方均为无机矿物或盐类、微生物、氨基酸、核酸、糖类、脂类及其他生物化合物的混合物,一般还加入了血清,培养基的pH缓冲系统一般依赖碳酸氢根和额外供给的CO2,因此大多数细胞需要长时程供应这些成份,以保障内部的pH调控。使用生长培养基可能衍生出的一个问题是激发光会导致某些常见培养基成分(维生素B、蛋白、酚红)发出荧光,造成背景信号增强,或产生活性氧,进而对所研究的细胞造成伤害。

细胞成像实验的另一个选择是使用盐溶液,后者能够提供更为透明的光学环境,但无法支持长时程的细胞生长。这些盐溶液以碳酸氢盐和额外的CO2供应作为缓冲体系,或含有HEPES一类的合成缓冲体系,以维持生理性pH值,成像用盐溶液配方无法支持细胞生长,在某些需要长时间观察的实验,或需要更高代谢活性和生长率的实验中可能会造成一些问题。

当前市面上也有一些专门为成像实验而研发的商品化培养基,基于生长培养基的解决方案即提供了专用于支持细胞生长的产品,而又不含传统生长培养基中造成背景荧光的组份,盐溶液配方能够提供良好的光学透明度和缓冲能力,最适于短时程观察。

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