内吞作用Endocytosis是指细胞通过吞没蛋白质或多糖等非颗粒物质而将其内化的过程。该过程对于细胞代谢和细胞信号非常重要。荧光蛋白和有机染料是对囊泡壁和囊泡内容物进行染色的非常有用的指示剂。由于囊泡pH会在内吞过程中发生改变,因此,也可利用pH指示剂检测内吞通路的整个过程。

 

 


荧光蛋白

荧光蛋白可用于特异性标记内吞途径中的相关组分,如早期内体early endosomes、晚期内体late endosomes或溶酶体lysosomes。使用先进便捷的 BacMam 技术,可通过转基因方法表达 RFP 或 GFP 融合蛋白,靶向细胞内特定的结构。内吞结构可在活细胞中检测,也可在固定细胞中进行另外的免疫组织化学分析。

BacMam 技术转导效率很高,瞬时转导细胞通常可表达融合蛋白约 5 天,在分裂缓慢的细胞(如一些原代细胞)中,实验已经证明可表达达两周。

内吞作用和胞饮作用

HeLa 细胞使用 CellLight Early Endosmes-GFPCellLight Late Endosmes-RFP共转导并孵育过夜。


葡聚糖偶联物

追踪荧光葡聚糖的内化是目前分析液相内吞作用的常规方法。pHrodo™ 荧光染料标记物可区分从早期内体early endosome到溶酶体lysosome形成的整个内吞途径,可提供最完整的解决方案,且无需淬灭或洗涤步骤。

pHrodo™ 荧光染料在中性 pH 值环境时几乎不发荧光,随着 pH 降低,Red(红色)或 Green(绿色)荧光信号会逐渐增强。而荧光信号的增强则可用来检测内吞途径/胞吞途径的过程。

Alexa Fluor 荧光标记偶联物也可用来检测内化过程,需要淬灭或洗涤步骤去除胞外信号。

内吞作用和胞饮作用

小鼠单核细胞/巨噬细胞(MMM 细胞,ATCC)在活细胞成像溶液中与 pHrodo™ Red dextran 10000 MW 进行孵育,并使用 NucBlue Live ReadyProbes™ 试剂进行复染。


LysoTracker 染料

LysoTracker 荧光探针可通过直接通过有机染料特异性标记酸性细胞器,无需使用转基因蛋白体系。  其荧光信号稳定,可覆盖一系列波长,但不区分溶酶体和其他酸性组分。

LysoTracker 荧光探针还可与其他荧光染料或蛋白结合使用进行多重分析。LysoTracker Deep Red 尤其适合与RFP 和 GFP 七一使用进行多重分析。

膜蛋白和LysoTracker 染料都能作为追踪溶酶体行为的有效工具。请根据选择指南选择相应的多重分析和固定兼容性方法

Microscopic image of a cell stained with LysoTracker Deep Red

采用 LysoTracker Deep Red 进行共定位标记


膜染料

另一种追踪内吞作用的手段是使用膜探针观察膜形态变化,检测囊泡的形成。

水溶性 FM 染料是亲脂性的,对细胞无毒性且在水性介质中几乎不发荧光。其可插入细胞膜的外部小叶中,并可发出多种不同颜色的强烈荧光。FM 染料会对细胞质膜染色并在内吞囊泡中内化。细胞表面膜的非特异性染色可通过洗涤去除,然后进行成像检测。

FM 1-43 特别适合用来研究活性依赖性囊泡循环机制,尤其是在活跃应激的神经元中。

内吞作用和胞饮作用

用活性氧类指示剂6-carboxy-2´,7´-dichlorodihydrofluorescein diacetate, di(acetoxymethyl ester)和FM 5-95 以及 Hoechst 33342 标记染色的牛肺动脉内皮细胞。

图中,红色荧光 FM 5-95标记细胞膜和早期内体;绿色荧光定位细胞质;蓝色荧光 Hoechst 33342 染料标记细胞核。

内吞作用和胞饮作用分析产品选择指南

 
读值
靶向内吞过程特定阶段的荧光蛋白稳定信号
检测范围
早期内体Early endosome
晚期内体Late endosome
溶酶体Lysosome
常用检测通道
FITC
TRITC
FITC
TRITC
FITC
TRITC
标记颜色
GFP
RFP
GFP
RFP
GFP
RFP
Ex/Em (nm)
488/510
555/584
488/510
555/584
488/510
555/584
Signal-To-Noise Ratio(信噪比)
光稳定性
参考文献
多重分析兼容性
活细胞
固定细胞
可固定
检测平台
显微镜成像 
产品规格
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
货号
 
Alexa Fluor® Dextran
读值
无需洗涤、无淬灭的荧光亮度检测形式,整个内吞过程中荧光信号增强 
内吞过程中,无论 pH 信号如何变化,荧光信号稳定需要洗涤步骤或淬灭细胞外信号
检测范围
监测早期内体early endosome到早期溶酶体lysosome的形成过程
内吞阶段无信号变动 
载体
葡聚糖Dextran 10,000 MW
葡聚糖Dextran 10,000 MW
葡聚糖Dextran 10,000 MW
常用检测通道
TRITC
FITC
多种波长选择
标记颜色
pHrodo™ Red
pHrodo™ Green
Alexa Fluor® dye series
Ex/Em (nm)
560/585
509/533
多重的
Signal-To-Noise Ratio(信噪比)
光稳定性
参考文献
多重分析箭筒性
活细胞
固定细胞
可固定
阴离子可固定
检测平台*
I, M, FC
I, M, FC 
产品规格
0.5 mg
0.5 mg
多种
货号
请查看下方选择指南表
* I = 显微镜成像,M = 微孔板,FC = 流式细胞分析。

 

Alexa Fluor® dextran葡聚糖选择指南

 
标准检测通道
荧光基团/偶联物
Ex/Em (nm)
规格
货号
Dextran,Alexa Fluor® 488,10,000 MW FITC Alexa Fluor® 488 495/519 5 mg D22910
Dextran,Alexa Fluor® 546,10,000 MW TRITC Alexa Fluor® 546 556/573 5 mg D22911
Dextran,Alexa Fluor® 546,10,000 MW Alexa Fluor® 555 555/565 5 mg D34679
Dextran,Alexa Fluor® 546,10,000 MW Rhodamine Alexa Fluor® 568 578/603 5mg D22912
Rhodamine,Alexa Fluor® 594,10,000 MW Texas Red® Alexa Fluor® 594 590/617 5 mg D22913
Rhodamine,Alexa Fluor® 647,10,000 MW Cy®5 Alexa Fluor® 647 650/668 5 mg D22914
Rhodamine,Alexa Fluor® 680,10,000 MW Cy®5.5 Alexa Fluor® 680 679/702 5 mg D34680
Rhodamine,Alexa Fluor® 680,10,000 MW TAMRA TAMRA 555/580 10 mg D3312
Dextran, Fluorescein and Biotin, 10,000 MW FITC Fluorescein 494/518 10 mg D7178
 
通过测定荧光强度定位溶酶体
检测范围
靶向纳摩浓度的酸性细胞器
常用检测通道
FITC
TRITC
Cy®5
荧光标记
LysoTracker® Green
LysoTracker® Red
LysoTracker® Deep Red
Ex/Em (nm)
504/511
577/590
647/668
Signal-To-Noise Ratio(信噪比)
光稳定性
参考文献
多重分析兼容性
活细胞
固定细胞
可固定
检测平台*
I, M, FC
产品规格
20 x 50 μL
20 x 50 μL
5 x 50 μL
货号
*> I = 显微镜成像,M = 微孔板,FC = 流式细胞分析。
 
读值
通过荧光强度对囊泡膜成像
检测范围
需要淬灭或洗涤去除细胞表面膜上的非特异性信号
常用检测通道
TRITC
TRITC
Texas Red®
长通Long pass 580
长通Long pass 580
长通Long pass 580
标记颜色
FM® 1-43
FM® 1-43FX
FM® 2-10
FM® 4-64
FM® 4-64FX
FM® 5-95
Ex/Em (nm)
471/581
471/581
506/620
558/734
565/744
560/734
Signal-To-Noise Ratio(信噪比)
光稳定性
参考文献
多重分析兼容性
活细胞
固定细胞
可固定
检测平台
显微镜成像
产品规格
10 × 100 µg
10 × 100 µg
5 mg
10 × 100 µg
10 × 100 µg
1 mg
货号
 
读值
靶向内吞过程特定阶段的荧光蛋白稳定信号
检测范围
早期内体Early endosome
晚期内体Late endosome
溶酶体Lysosome
常用检测通道
FITC
TRITC
FITC
TRITC
FITC
TRITC
标记颜色
GFP
RFP
GFP
RFP
GFP
RFP
Ex/Em (nm)
488/510
555/584
488/510
555/584
488/510
555/584
Signal-To-Noise Ratio(信噪比)
光稳定性
参考文献
多重分析兼容性
活细胞
固定细胞
可固定
检测平台
显微镜成像 
产品规格
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
货号
 
Alexa Fluor® Dextran
读值
无需洗涤、无淬灭的荧光亮度检测形式,整个内吞过程中荧光信号增强 
内吞过程中,无论 pH 信号如何变化,荧光信号稳定需要洗涤步骤或淬灭细胞外信号
检测范围
监测早期内体early endosome到早期溶酶体lysosome的形成过程
内吞阶段无信号变动 
载体
葡聚糖Dextran 10,000 MW
葡聚糖Dextran 10,000 MW
葡聚糖Dextran 10,000 MW
常用检测通道
TRITC
FITC
多种波长选择
标记颜色
pHrodo™ Red
pHrodo™ Green
Alexa Fluor® dye series
Ex/Em (nm)
560/585
509/533
多重的
Signal-To-Noise Ratio(信噪比)
光稳定性
参考文献
多重分析箭筒性
活细胞
固定细胞
可固定
阴离子可固定
检测平台*
I, M, FC
I, M, FC 
产品规格
0.5 mg
0.5 mg
多种
货号
请查看下方选择指南表
* I = 显微镜成像,M = 微孔板,FC = 流式细胞分析。

 

Alexa Fluor® dextran葡聚糖选择指南

 
标准检测通道
荧光基团/偶联物
Ex/Em (nm)
规格
货号
Dextran,Alexa Fluor® 488,10,000 MW FITC Alexa Fluor® 488 495/519 5 mg D22910
Dextran,Alexa Fluor® 546,10,000 MW TRITC Alexa Fluor® 546 556/573 5 mg D22911
Dextran,Alexa Fluor® 546,10,000 MW Alexa Fluor® 555 555/565 5 mg D34679
Dextran,Alexa Fluor® 546,10,000 MW Rhodamine Alexa Fluor® 568 578/603 5mg D22912
Rhodamine,Alexa Fluor® 594,10,000 MW Texas Red® Alexa Fluor® 594 590/617 5 mg D22913
Rhodamine,Alexa Fluor® 647,10,000 MW Cy®5 Alexa Fluor® 647 650/668 5 mg D22914
Rhodamine,Alexa Fluor® 680,10,000 MW Cy®5.5 Alexa Fluor® 680 679/702 5 mg D34680
Rhodamine,Alexa Fluor® 680,10,000 MW TAMRA TAMRA 555/580 10 mg D3312
Dextran, Fluorescein and Biotin, 10,000 MW FITC Fluorescein 494/518 10 mg D7178
 
通过测定荧光强度定位溶酶体
检测范围
靶向纳摩浓度的酸性细胞器
常用检测通道
FITC
TRITC
Cy®5
荧光标记
LysoTracker® Green
LysoTracker® Red
LysoTracker® Deep Red
Ex/Em (nm)
504/511
577/590
647/668
Signal-To-Noise Ratio(信噪比)
光稳定性
参考文献
多重分析兼容性
活细胞
固定细胞
可固定
检测平台*
I, M, FC
产品规格
20 x 50 μL
20 x 50 μL
5 x 50 μL
货号
*> I = 显微镜成像,M = 微孔板,FC = 流式细胞分析。
 
读值
通过荧光强度对囊泡膜成像
检测范围
需要淬灭或洗涤去除细胞表面膜上的非特异性信号
常用检测通道
TRITC
TRITC
Texas Red®
长通Long pass 580
长通Long pass 580
长通Long pass 580
标记颜色
FM® 1-43
FM® 1-43FX
FM® 2-10
FM® 4-64
FM® 4-64FX
FM® 5-95
Ex/Em (nm)
471/581
471/581
506/620
558/734
565/744
560/734
Signal-To-Noise Ratio(信噪比)
光稳定性
参考文献
多重分析兼容性
活细胞
固定细胞
可固定
检测平台
显微镜成像
产品规格
10 × 100 µg
10 × 100 µg
5 mg
10 × 100 µg
10 × 100 µg
1 mg
货号