Streptavidin—signal amplification for imaging

For improved detection sensitivity, steptavidin-based amplification techniques are widely used in fluorescence imaging to detect biotinylated biomolecules such as primary and secondary antibodies, ligands and toxins, or DNA probes for in situ hybridization.

Streptavidin-based detection provides signal amplification for medium- and low-abundance targets with a simple workflow.

为了进一步提高检测灵敏度,基于链霉亲和素的信号放大技术广泛应用于荧光成像实验,以检测生物素化的生物分子,例如一抗和二抗、配体和毒素、或原位杂交中的DNA探针。

基于链霉亲和素的检测技术通过一个简单的操作步骤,为中等丰度和低丰度的靶标提供了有效的信号放大作用。

生物素结合的蛋白家族包括链霉亲和素(streptavidin)、亲和素(avidin)和NeutrAvidin蛋白,每个蛋白都能够以高度的亲和力和特异性结合四个生物素分子。其中最常使用的是链霉亲和素,它未经糖基化且具有很低的非特异性结合水平。亲和素则是一种高度阳离子化的糖蛋白,等电点在10.5左右,它的正电荷残基和低聚糖成份能够介导非特异性结合,从而在某些应用中导致本底过高的问题。NeutrAvidin蛋白经过去糖基化处理和降低等电势点,从而减少了其背景着色。

何种情况下适合使用基于链霉亲和素的放大技术?

Life Technologies提供了最为完整的荧光成像检测技术。通过使用这些工具套装,您可以针对您的靶标丰度选择最佳的检测技术,并通过使用波长兼容的染料实现多色检测实验。

  • 高丰度靶标——一级偶联物,无需进行信号放大
  • 中等丰度靶标——二级偶联物,适度信号放大
  • 中低丰度靶标——链霉亲和素偶联物,需要显著增强信号
  • 低丰度靶标——酶学放大,以获得最大的信号增强效果
 

封闭内源性生物素

哺乳动物细胞和组织中包含依赖生物素的羧化酶,它们为多种代谢功能所需。这些包含生物素的酶类通常会在用于鉴定细胞靶标的生物素-链霉亲和素检测系统,或生物素-亲和素检测系统中产生严重的本底信号干扰。内源性生物素尤其在线粒体中和肾脏、肝脏、脑组织中广泛存在。

当您使用生物素-链霉亲和素检测系统检测高内源性生物素水平的细胞或组织内的靶标时,内源性生物素封闭试剂盒(Endogenous Biotin-Blocking Kit,EBK)能够帮助您减弱本底信号。

图1.  Alexa Fluor488 链霉亲和素靶向高尔基体同时也结合内源性的生物素(左图),从而产生非特异性标记;内源性生物素封闭试剂盒则能够降低非特异性的标记和绿色本底信号(右图)。

如何选择链霉亲和素偶联物?

链霉亲和素有多种与荧光染料结合的偶联物,可以对很多靶标进行标记和成像。传统染料偶联物用于大多数标准化操作流程中,让您能够在很宽的波长范围内实现对靶标的成像;而Alexa Fluor偶联物则可提供更明亮的荧光信号,并能有效抵抗标准光源及波长设置下的光漂白作用;Qdot偶联物则为直接成像提供了最为明亮的荧光信号,光漂白作用非常微弱或几乎没有。

 

  Qdot偶联物 AlexaFluor偶联物
传统染料偶联物
可用标准光源或滤光片获得最优信号  
耐光漂白作用
广泛的波长范围
使用优化滤光片获得最强信号    
细胞膜表面与胞质内的靶标
核内靶标  

Qdot 偶联物具有最好的光亮度和光稳定性

  Qdot偶联物可为直接成像实验提供最为明亮的检测信号,其光漂白作用很弱或几乎没有,即使在后续长期实验中也是如此。可使用标准光源或滤光片对Qdot进行观察,但要想获得最理想的信号强度,则建议使用专门的滤光片。对于细胞膜表面与胞质内靶标,Qdot偶联物也能够提供很强烈的追踪信号;而对于核内靶标的成像,使用如Alexa Fluor等有机染料标记物则可能获得更为理想的标记效果。

Alexa Fluor偶联物用于高性能成像

  AlexaFluor链霉亲和素偶联物能够在使用普通显微镜设置、光源或滤光片的条件下提供最让您满意的荧光亮度和光稳定性。Alexa Fluor染料的发射光谱覆盖整个可见光和红外线光谱范围,能够方便地用于多色标记分析。Alexa Fluor有机染料都能够很容易地进入到细胞核和胞质结构并标记靶蛋白,进行成像和分析。

传统染料偶联物用于常规分析

  传统染料如荧光素(FITC)、罗丹明(TRITC)和Texas Red等标记生物素结合蛋白质,您可以按照标准流程操作并对细胞核与胞质内靶标进行特定波长下的成像分析。传统染料的偶联物适用于表达量高且最大亮度和光稳定性不太重要的靶标。

其他辅助成像试剂

为了帮助您在固定细胞和组织切片的免疫荧光成像实验中使用荧光标记链酶亲和素偶联物获得最佳结果,我们推出了Image -iTFX Kits来为您提供所需的全套试剂。

每一个试剂盒都提供了足够进行50-100次检测的试剂,包括: