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膜渗透性 JC-1 染料被广泛用于细胞凋亡研究,以监测线粒体健康。 在多种细胞(包括肌细胞、神经元细胞)以及完整组织和离体线粒体中,JC-1 染料可用做线粒体膜电位的指示剂。 我们提供的 Invitrogen JC-1 染料具有大包装试剂和 Invitrogen MitoProbe JC-1 检测试剂盒两种形式,均针对流式细胞分析进行了优化。

参见 JC-1 染料订购信息
参见 MitoProbe JC-1 检测试剂盒的引用文献
参见 JC-1 染料的引用文献

细胞凋亡中的线粒体膜电位变化

凋亡早期

细胞程序化死亡的早期显著特征是活性线粒体的破裂。 线粒体的破裂特征包括膜电位的改变以及线粒体氧化-还原电位的改变。 膜电位改变的原因可能是由于线粒体转换孔开放(MPTP),使得离子与小分子进入线粒体所致。 因此导致的离子平衡使得呼吸链去耦联,进而释放细胞色素 c 进入细胞质。

线粒体选择性试剂

检测线粒体膜电位的探针带正电荷,导致它们积聚在带负电的线粒体内部。 线粒体膜电位变化可以通过各种荧光技术进行检测,如流式细胞分析和荧光成像。 线粒体选择性试剂使研究人员能够探测线粒体的活性、定位和丰度,并监测一些药物的作用,如改变线粒体功能的麻醉药。

JC-1 染料作为线粒体膜电位指示剂

研究性线粒体健康

膜渗透性 JC-1 染料被广泛用于细胞凋亡研究,以监测线粒体健康。 荧光发射由绿色(~529 nm)转变为红色(~590 nm),表明JC-1染料积累在线粒体中并呈电位依懒性特征。 因此,红色/绿色荧光强度比例降低代表线粒体去极化。 电位敏感性颜色变化是由红色荧光J聚合物的浓度依赖性形成而产生的。

JC-1 染料用途广泛

在多种细胞(包括肌细胞、神经元细胞)以及完整组织和离体线粒体中,JC-1 染料可用做线粒体电位的指示剂。 与细胞膜电位相比,JC-1 染料对线粒体的特异性更强,而且与其它阳离子染料(如DiOC6(3) 和罗丹明 123)相比,JC-1对去极化的响应更稳定。 绿色与红色荧光的比例仅取决于膜电位,与线粒体大小、形状和密度等可能影响单组份荧光信号的其他因素无关。 因此,荧光比值检测法支持研究者对膜电位进行比照检测,而且可确定施加刺激响应的细胞群体中线粒体的比例。

采用该方法可以区分细胞响应的细微差别。  比如,采用共轭焦的 JC-1 染料荧光比例成像,可区分神经元对谷氨酸受体激活响应四种不同的线粒体膜电位改变。 JC-1 染料的最常见应用是检测细胞凋亡中的线粒体去极化。

试剂选择指南

产品  Ex/Em (nm)  细胞状态 可固定 平台 数量 货 号
MitoProbe JC-1 检测试剂盒 514/529 直播 流式细胞分析 100 个反应 M34152
JC-1 染料 514/529 直播 FC, I 5 mg T3168

图像和数据

JC-1 染色的 NIH 3T3 成纤维细胞

使用 JC-1 对 NIH 3T3 成纤维细胞进行染色,结果显示在暴露于过氧化氢后,红色J聚合物的荧光逐渐丧失,绿色单体荧光在细胞质中扩散。 H2O2 处理前和处理后 5、10 和 20分 钟时的图像均为相同的细胞区域。

加入比率式线粒体电位指示剂 JC-1 的人前体脂肪细胞

在培养的人前体脂肪细胞中加入 5 µM 比率式线粒体电位指示剂 JC-1,并在37°C孵育30分钟。在活细胞中,JC-1在去极化膜电位情况下呈现为绿色荧光单体,在超极化膜电位情况下呈现为橙色荧光J聚合物。 随后,使用 50 nM FCCP 质子载体处理细胞,使线粒体膜去极化。 加入解偶联剂后约 10 分钟,在 488 nm 处照射细胞并收集 515/545 nm 和 575/625 nm 之间的发射光。 (图片由丹麦 BioImage A/S 公司的 Bob Terry 提供。)

使用 JC-1 对 CCL64 成纤维细胞中的线粒体染色。

使用 JC-1 对 CCL64 成纤维细胞中的线粒体进行电位依赖性染色。 使用荧光显微镜的 520 nm 长通光学滤光片观察线粒体。 高线粒体极化区域因高浓度染料形成 J 聚合物而发出红色荧光。 去极化区域呈现为 JC-1 单体的绿色荧光。 (图片由哈佛医学院丹娜法伯癌症研究院的 Lan Bo Chen 提供。)

使用 MitoProbe JC-1 检测试剂盒对 Jurkat 细胞进行流式细胞分析

使用 MitoProbe JC-1 检测试剂盒对 Jurkat 细胞进行流式细胞分析。向 Jurkat 细胞中加入 2 μM JC-1,并在37°C、5% CO2 条件下孵育 15分钟,然后使用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)清洗细胞,并在流式细胞仪上使用 488 nm 激发光以及 530 nm 和 585 nm 带通发射滤光片进行分析。 (A)未处理的培养细胞。 (B) 使用 10 μM 喜树碱 37°C 处理 4 小时以诱导凋亡的细胞。

用于流式细胞分析的 MitoProbe JC-1 检测染色方案

以下方案描述了如何使用 JC-1 试剂对培养细胞染色并通过流式细胞术分析染色细胞。 推荐初始条件可能需根据不同的细胞类型和培养条件进行改进。 获得最佳染色效果所需的探针浓度取决于具体应用。 浓度范围应从 2 µM JC-1 开始测试。 应使用 CCCP 对照确认 JC-1 反应对膜电位变化是否敏感。

试剂准备

使用前,将 JC-1 粉末和 DMSO 溶液平衡至室温。 将一管粉末溶于 230 µL DMSO 溶液中,以制备 200 µM JC-1 储液,现配现用。

标记细胞

开始实验前,务必将 CCCP 平衡至室温。

  • 1.1 对于每个样品,将细胞悬浮于 1 mL 温热的培养基、磷酸盐缓冲生理盐水或其他缓冲液中,浓度约为 1×106 细胞/mL。
  • 1.2 向对照样品管中加入 1 µL 的 50 mM CCCP(包含在试剂盒中,终浓度为 50 µM),并将细胞在 37°C 孵育 5 分钟。 注意: CCCP 可与 JC-1 同时加入。 为使单个细胞系统获得最佳结果,可能需要进行 CCCP 滴定。
  • 1.3 加入 10 µL 的 200 µM Jc-1(终浓度为 2 µM),并将细胞在 37°C、5% CO2 条件下孵育 15-30 分钟。 如果需要附加标记,如使用 annexin V 偶联物标记,则使用下文中从步骤 2.1 开始的方案。 如果不需要继续染色,则进入步骤 1.4。
  • 1.4 可选: 向每管细胞中加入2 mL温热的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)或其他缓冲液,清洗细胞一次。
  • 1.5 离心,使细胞沉淀。
  • 1.6 轻弹样品管,使细胞重悬。 向每管中加入 500 µL PBS(或其他合适的缓冲液)。
  • 1.7 在流式细胞仪上使用 488nm 激发光以及适用于 Invitrogen Alexa Fluor 488 染料和 R-藻红蛋白的滤光片进行分析。 对细胞设门,排除细胞碎片。 使用 CCCP 处理样品进行标准补偿。

使用 annexin V 偶联物进行附加标记

可以使用其他细胞凋亡或细胞活性标记物对JC-1染色细胞进行标记,因为这些附加标记发射的荧光在光谱上可与JC-1分辨。 下述实例是使用annexin V-别藻蓝蛋白进行标记的实验方案。

  • 2.1 在步骤1.3(前文所述)之后,向每管细胞中加入2 mL温热的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)或其他缓冲液,清洗细胞一次。
  • 2.2 离心JC-1染色细胞使其沉淀,并重悬于100 µL 1X annexin结合缓冲液(10 mM HEPES、140 mM NaC和2.5 mM CaCl2,pH 7.4)中。
  • 2.3 加入 5 µL annexin V 荧光试剂(如 Invitrogen annexin V-别藻蓝蛋白)。 注意: 5 µL 适用于Invitrogen annexin V 偶联物。 其他品牌的产品可能需要不同体积才能达到相同效果。

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