神经元细胞培养的标准 再度提升

自1993 年起,Gibco B-27 添加剂和Neurobasal神经元基础培养基就已经成为一系列神经元培养应用的公认标准,引用文献超过 11,000 篇。但随着科学家对于更可靠、更具生物学相关性模型建立的需求越来越强烈,越来越需要诞生新一代的培养基体系,使其能够满足在体外长期维持和成熟处于最佳培养密度的功能神经元的需求。

为了满足这一需求,我们开发了新一代 Gibco B-27 Plus 神经元培养体系。该体系采用更优化的配方、升级的生产工艺,以及更严格的原材料和终产品质控手段。这些改进带来了如下优势:

  • 神经元存活率提高 50%— 业内最高;
  • 神经突起生长和成熟加快,神经元电生理活性显著提升;
  • 配合CultureOne添加剂,可显著改善神经胶质细胞过度增殖现象;
  • 搭配Nunc Lab-Tek Ⅱ CC2腔室玻片系统,专为神经元贴壁生长提供优化表面,令免疫标记和显微观察更得心应手。

Gibco B-27 Plus 神经元培养体系包括

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经验证配合使用效果最佳—可根据需要订购便利、高性价比的整套体系,或者按需要重新订购单独的组分

经验证可以无缝替代其他神经元培养体系,如经典的常规版 B-27 添加剂和神经元基础培养基,同时无需改动现有工作流程:

  • 可维持原代大鼠、小鼠和人 PSC 来源及胚胎来源的神经元
  • 使人 PSC 来源和胚胎来源的神经干细胞 (NSC) 分化成神经元
     

关键优势和代表数据

相比经典产品,神经元存活率可提高 50% 以上

图 1.相对于 B-27 添加剂和Neurobasal神经元基础培养基,B-27 Plus 神经元培养体系可以维持更高的神经元存活率。 Gibco大鼠原代皮质神经元在上述培养体系中培养可达 3 周,分别在 7、14 和 21 天时对 MAP2进行免疫染色。

图 2.相对于 B-27 添加剂和Neurobasal神经元基础培养基,B-27 Plus 神经元培养体系对原代啮齿来源及诱导多能干细胞 (iPSC) 来源的神经元培养效果更好。冻存的神经元在上述培养体系中培养3–4 周。在指定的时间点,采用神经元树突标记物 MAP2(绿色)和神经元细胞体标记物 HuC/D(红色)进行免疫染色。细胞核使用 DAPI(蓝色)复染。

改善了电生理活性和成熟度

图 3.相对于 BrainPhys 神经元培养基和 SM1 试剂盒,电生理活性显著提升。原代大鼠皮质神经元接种于48孔多电极阵列 (MEA) 板上。按照供应商推荐的实验方案,将细胞在上述培养基体系中培养 35 天。使用 Axion BioSystems™ Maestro™ MEA 平台全程记录自发性电生理活性。数据来源于四次平行实验的一次,每次实验的趋势相近。B-27 Plus 神经元培养体系可长期维持一致、稳定、高度同步的自发性电生理活性。

图 4.神经元成熟度相对于 B-27 添加剂和Neurobasal神经元基础培养基增强。原代大鼠皮质神经元在生长22 天时,采用树突标记物 MAP2(红色)和突触素 1/2 染色,标记突触前末梢(绿色)。在 B-27 Plus 神经元培养体系中维持的神经元的点状突触阳性信号明显更高。

相对于替代培养基体系,可实现最高的神经元存活率

图 5.与其他市售无血清神经元培养基体系相比,B-27 Plus 神经元培养体系可在神经元长期培养应用中达到最高的细胞存活率。将已成熟 9 天的原代大鼠皮质神经元原代大鼠海马体神经元原代小鼠皮质神经元和人 iPSC 来源神经元冻存后 (HIP™ Neurons, MTI-GlobalStem) ,在含 B-27 添加剂的经典Neurobasal神经元基础培养基中复苏。将神经元接种于多聚D-赖氨酸包被的 96 孔板上,根据供应商推荐的实验方案分别使用 B-27 Plus 神经元培养体系和其他无血清培养基体系维持 3-4 周。在神经元培养3或4周时,采用Invitrogen HuC/HuD 单克隆抗体免疫荧光染色,定量神经元存活率。显示的数据来自于三次平行实验的一次,每次运行均显示,与其他替代体系相比,B-27 Plus 神经元培养体系可实现最高的神经元细胞存活率。

图 6.相对于 B-27 添加剂和Neurobasal神经元基础培养基及替代培养基体系,可加速神经突触生长。在含有 B-27 添加剂的经典神经元基础培养基中复苏原代小鼠皮质神经元 并接种于多聚-D-赖氨酸包被的 96 孔板上。按照供应商推荐的实验方案,分别使用含有 经典B-27 添加剂的Neurobasal神经元基础培养基、含有 B-27 Plus 添加剂的 Neurobasal Plus 培养基以及其他市售无血清培养基体系中维持神经元。在指定时间点拍摄微分干涉对比图,用以定量神经突触生长情况。相对于含有 B-27 添加剂的经典神经元基础培养基, B-27 Plus 神经元培养体系在前几周可显著加速神经突触生长。显示的数据来自于其中三次平行实验的一次,每次运行均显示 B-27 Plus 神经元培养体系的平均神经突触长度高过替代体系。

相比经典产品,神经元存活率可提高 50% 以上

图 1.相对于 B-27 添加剂和Neurobasal神经元基础培养基,B-27 Plus 神经元培养体系可以维持更高的神经元存活率。 Gibco大鼠原代皮质神经元在上述培养体系中培养可达 3 周,分别在 7、14 和 21 天时对 MAP2进行免疫染色。

图 2.相对于 B-27 添加剂和Neurobasal神经元基础培养基,B-27 Plus 神经元培养体系对原代啮齿来源及诱导多能干细胞 (iPSC) 来源的神经元培养效果更好。冻存的神经元在上述培养体系中培养3–4 周。在指定的时间点,采用神经元树突标记物 MAP2(绿色)和神经元细胞体标记物 HuC/D(红色)进行免疫染色。细胞核使用 DAPI(蓝色)复染。

改善了电生理活性和成熟度

图 3.相对于 BrainPhys 神经元培养基和 SM1 试剂盒,电生理活性显著提升。原代大鼠皮质神经元接种于48孔多电极阵列 (MEA) 板上。按照供应商推荐的实验方案,将细胞在上述培养基体系中培养 35 天。使用 Axion BioSystems™ Maestro™ MEA 平台全程记录自发性电生理活性。数据来源于四次平行实验的一次,每次实验的趋势相近。B-27 Plus 神经元培养体系可长期维持一致、稳定、高度同步的自发性电生理活性。

图 4.神经元成熟度相对于 B-27 添加剂和Neurobasal神经元基础培养基增强。原代大鼠皮质神经元在生长22 天时,采用树突标记物 MAP2(红色)和突触素 1/2 染色,标记突触前末梢(绿色)。在 B-27 Plus 神经元培养体系中维持的神经元的点状突触阳性信号明显更高。

相对于替代培养基体系,可实现最高的神经元存活率

图 5.与其他市售无血清神经元培养基体系相比,B-27 Plus 神经元培养体系可在神经元长期培养应用中达到最高的细胞存活率。将已成熟 9 天的原代大鼠皮质神经元原代大鼠海马体神经元原代小鼠皮质神经元和人 iPSC 来源神经元冻存后 (HIP™ Neurons, MTI-GlobalStem) ,在含 B-27 添加剂的经典Neurobasal神经元基础培养基中复苏。将神经元接种于多聚D-赖氨酸包被的 96 孔板上,根据供应商推荐的实验方案分别使用 B-27 Plus 神经元培养体系和其他无血清培养基体系维持 3-4 周。在神经元培养3或4周时,采用Invitrogen HuC/HuD 单克隆抗体免疫荧光染色,定量神经元存活率。显示的数据来自于三次平行实验的一次,每次运行均显示,与其他替代体系相比,B-27 Plus 神经元培养体系可实现最高的神经元细胞存活率。

图 6.相对于 B-27 添加剂和Neurobasal神经元基础培养基及替代培养基体系,可加速神经突触生长。在含有 B-27 添加剂的经典神经元基础培养基中复苏原代小鼠皮质神经元 并接种于多聚-D-赖氨酸包被的 96 孔板上。按照供应商推荐的实验方案,分别使用含有 经典B-27 添加剂的Neurobasal神经元基础培养基、含有 B-27 Plus 添加剂的 Neurobasal Plus 培养基以及其他市售无血清培养基体系中维持神经元。在指定时间点拍摄微分干涉对比图,用以定量神经突触生长情况。相对于含有 B-27 添加剂的经典神经元基础培养基, B-27 Plus 神经元培养体系在前几周可显著加速神经突触生长。显示的数据来自于其中三次平行实验的一次,每次运行均显示 B-27 Plus 神经元培养体系的平均神经突触长度高过替代体系。

推荐应用

B-27 Plus 添加剂和 Neurobasal Plus 培养基采用与当前目录产品同一的包装,并采用与之完全相同的实验方案。经典 B-27 和Neurobasal神经元基础培养基产品仍会继续供货;但在以下应用中,我们建议采用 Plus 版搭配其他培养基和添加剂的组合:

实验应用 推荐的添加剂 推荐的基础培养基
出生前/胚胎原代神经元的维持/成熟 B-27 Plus 添加剂 Neurobasal Plus 培养基
干细胞来源神经元的分化及维持/成熟 B-27 Plus 添加剂 

CultureOne 添加剂
Neurobasal Plus 培养基
电生理学研究 B-27 Plus 添加剂 Neurobasal Plus 培养基
神经干细胞扩增 StemPro NSC SFM 添加剂
或者
B-27 添加剂,去除维生素 A/N-2 添加剂
KnockOut DMEM/F-12 基础培养基
新生儿和成体大脑神经元的维持/成熟 B-27 Plus 添加剂 Neurobasal-A 培养基
胰岛素分泌或胰岛素受体的研究 B-27 添加剂,无胰岛素 Neurobasal-A 培养基
转化细胞疗法(需要无异种组分的研究) CTS B-27 添加剂,无异种成分 CTS Neurobasal神经元基础培养基
或者
CTS Neurobasal-A 培养基
氧化应激及损伤、凋亡的研究,或自由基对神经元损伤的情形 B-27 添加剂,无抗氧化剂 Neurobasal Plus 培养基

最佳搭配

Nunc Lab-Tek Ⅱ CC2 腔室玻片系列,专为神经细胞优化的生长表面,易于贴壁生长。
结构设计更有利于气体交换并减少培养基蒸发,为免疫鉴定及显微观察提供方便。

图注:PC12细胞在不同表面上生长的分布及形态比较。

订购信息

重新订购系统组件

FAQ

问题 答案
B-27 Plus 添加剂和经典 B-27 添加剂有何区别? B-27 Plus 添加剂针对经典 B-27 的配方进行了优化。 未添加小分子或生长因子。
Neurobasal Plus 培养基和Neurobasal神经元基础培养基有何区别? Neurobasal Plus 培养基中的主要氨基酸和缓冲组分进行了优化。未添加小分子或生长因子。
你们如何升级生产/质检工艺? 我们简化了生产流程,实施了更严格的验收标准并采用更严格的质检方法检验原材料的纳入和终产品的发布,实现了更好的批次间一致性。
我可以将 B-27 Plus 分装重新冷冻,以便今后使用吗? 可以,但我们建议您在初次解冻时分存。同时,我们建议冻融循环不要超过 2 次。
我可以采用 B-27 Plus 神经元培养体系扩增增殖细胞吗,如神经干细胞? 不可以,我们不建议采用 B-27 Plus 体系扩增增殖细胞。我们建议采用 StemPro NSC SFM、神经诱导培养基添加剂或 B-27 添加剂(不含维生素 A)培养增殖细胞,如 NSCs。
我可以使用 B-27 Plus 体系维持神经元多久? 我们维持原代大鼠皮层神经元达 8 周,维持大鼠海马体神经元 达4 周。小鼠皮质神经元可维持 4 周。人 iPSC 来源神经元 (MTI-GlobalStem 的 HIP™ 神经元) 维持 5 周。所有采用 B-27 Plus 体系测试的细胞在所有时间点的健康程度均明显强于经典产品。
我必须要将 B-27 Plus 搭配 Neurobasal Plus使用 吗? B-27 Plus 添加剂和 Neurobasal Plus 培养基设计初衷就是为了协同配合实现最佳性能。但他们仍可根据需要搭配其他基础培养基或添加剂使用。
我该如何控制培养体系中的神经胶质细胞的数目? 在培养第 0 天在 B-27 Plus 神经元培养体系中添加 CultureOne 添加剂,以完全抑制星形胶质细胞和少突细胞,同时对神经元无影响。延迟到较晚的时间点加入 CultureOne,会导致星形胶质细胞水平增加。更多信息请见 CultureOne 添加剂用户指南。
我可以采用 B-27 Plus 神经元培养体系培养非神经元细胞吗? 我们未采用其他细胞进行过测试,B-27 Plus 体系就是为了培养神经元细胞而设计的。
我可以采用 B-27 Plus 和 Neurobasal Plus 替代哪些经典 B-27 和Neurobasal神经元基础培养基产品? 可替换以下实验方案之中的常规版 B-27 添加剂和神经元基础 培养基(非去除胰岛素、去除维生素A或 Neurobasal-A 等的特殊版):
- 维持原代大鼠、小鼠和人 PSC 来源和胚胎来源的神经元
- 人 PSC 来源和胚胎来源的神经干细胞 (NSC) 分化成神经元
添加了 Neurobasal Plus 的完整培养基可在多长时间内使用? 完整的 Neurobasal Plus 培养基应在补充 B-27 Plus 添加剂后 4 周内使用。
融解的 B-27 Plus 添加剂可在 4C 下保存吗? 可以,B-27 Plus 添加剂可在融解后在 4C 条件下储存达 2 周。
B-27 Plus 添加剂和 Neurobasal Plus 培养基的保质期为多久? 1 年
如果我的细胞未贴壁或出现结块怎么办? 在原代神经元培养中,这通常是包被不均匀或神经元接种密度过高所致。在 NSC 分化实验中,这可能是由于神经前体细胞过渡增殖所致。采用 B-27 Plus 神经元培养体系和 CultureOne 添加剂的组合进行分化,可以消除 75% 以上的神经前体细胞及其结块现象。更多信息请见 CultureOne 添加剂。
HuC/D 是什么? HuC/D 是一种专用于神经元细胞体的抗体,可用来定量培养液中的神经元。
我该如何融解 B-27 Plus 添加剂? 在 4C 下过夜解冻,或者在室温下解冻 2 小时。我们不建议采用水浴或培养箱解冻。
在 37C 水浴或培养箱中解冻 B-27 Plus 添加剂会有什么后果? 不建议这么做。
我该如何为在 B-27 Plus 神经元培养体系之中的细胞补充培养液? 接种后每 2-3 天置换一半的培养基。置换时请勿完全移除培养基,以免神经元完全暴露在空气中。

资源

支持

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