转染

1)从健康细胞开始

a. 转染实验前,细胞解冻后传代3–4次。 这使得细胞从解冻过程中恢复过来,并恢复正常的生长速度。

b. 仅使用活性 >90%的细胞——使用台盼蓝染色可轻松测定细胞活性。

c. 定期传代细胞,切勿让细胞长到汇合状态或过度生长。 如果让细胞长到汇合状态,可能会改变细胞的生长速度以及形态。

i. 请在汇合率达到90%之前对细胞进行传代。 我们建议您使用TrypLE™试剂使细胞脱壁。 TrypLE™试剂可于室温下存储在通风橱中。可通过添加过量的TrypLE™来跳过PBS洗涤的步骤,然后吸弃全部液体,仅留可覆盖瓶子表面的液体。

ii. 传代条件取决于所用的细胞系。 部分经验法则:

  • 对于快速生长的细胞,倍增时间为16小时(如HEK-293细胞),按1:10的比例分瓶。
  • 对于生长缓慢的细胞,倍增时间为36小时(如原代细胞),按1:5的比例分瓶。

d. 保留冻存的细胞系,并定期解冻新细胞。 传代次数高(>30–40)时,细胞的生长速度和形态会改变。

2) 进行实验之前,请先规划您的实验。

务必要熟悉实验方案、确定所需的材料量,并在开始实验前确认所需的一切物品条件均已齐备。

a. 开始前,设计好铺板路线图,标注好每次处理或实验条件。

b. 计算所需脂质体和DNA的储备量,并确认有足够的下列材料: Opti-MEM® 培养基,Lipofectamine® 2000 或Lipofectamine® LTX试剂,以及DNA (0.5–1 µg/µL)。

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3) 转染时,请使用优质DNA。

a. 使用无内毒素的试剂盒和实验方案制备DNA。

b. 通过测量OD 260/280值来确定DNA纯度,测得的OD值应介于1.7–1.9]之间。数值过高或过低均说明有杂质,不宜用于转染实验。

c. 在无DNA/RNA酶的水或TE中稀释DNA。

d. 制备的工作浓度为0.5–1 µg/µL。 可用SpeedVac®浓缩仪或透析过滤装置(例如,Amicon®超滤管)来浓缩DNA。

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4) 转染当天,将细胞铺板。

a. 如果在转染前一天或更早时间铺板,转染效率可能下降。

b. 转染时,细胞密度保持在汇合率为70–90%。

c. 转染时,细胞密度影响转染效率。 为了简化转染优化过程或节省时间,我们建议细胞铺成2种不同的密度,以确保较高的转染效率。

d. 细胞的铺板和转染可同时进行,或者通过反向转染操作进行。 反向转染操作中,使用的细胞是正常/正向转染的2.5倍以上。

e. 转染复合物可以加到含抗生素和血清的培养基中,且不会影响转染效率。

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5) 准备脂质体-DNA复合物。

a. 为了获得最佳的试验结果,我们建议在Opti-MEM®培养基中混合脂质体和DNA。 另一种方法是使用无血清培养基。

b. 在Opti-MEM®培养基中稀释脂质体。 在第二管Opti-MEM®培养基中稀释DNA,然后和等体积脂质体溶液混合。 该2步稀释法可获得更优质的数据,比脂质体直接加入稀释的DNA中的方法获得的结果更有重复性。

c. 脂质体一旦在Opti-MEM®培养基中稀释,在加入稀释的DNA之前,最佳孵育时间为2- 5分钟。 稀释的脂质体孵育时间不要超过20]分钟。

d. DNA的Opti-MEM®溶液更加稳定,最早可以提前4小时制备,但不要太早。

e. 等体积稀释的脂质体和DNA溶液等体积混在一起后,通过缓慢地上下吹打来混合溶液,也可轻弹试管底部,或者快速涡旋混合。

f. 脂质体/DNA复合物温育5-10小时后,将复合物转移到含有细胞和生长培养基的孔中。 将复合物滴加到培养基上,然后轻轻地晃动板子。 切勿剧烈地将孔中的脂质体/DNA复合物分散,否则会使细胞移位。

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6) 利用含GFP或LacZ之类报告基因的质粒作为阳性对照,评估转染效率。

利用显微镜(例如FLoid™细胞成像工作站)或流式细胞仪(例如Attune®声波聚焦流式细胞仪)可轻松测定转染细胞和GFP蛋白表达细胞的百分比。 可使用ToxBLAzer™试剂盒来测定LacZ基因的表达。

a. 转染后24-48小时,应该可以看到或检测到质粒的表达。

b. 阳性对照可以放在一个单独的孔中,或是与感兴趣的质粒共转染。 共转染过程中,在加入稀释的脂质体之前,可在Opti-MEM®培养基中将50–100ng带GFP的质粒和100 ng感兴趣的质粒混合。

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仅供研究使用。 不得用于人类或动物的治疗或诊断用途。
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