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为了研究RNA的功能,通常通过逆转录(RT)将RNA转化为更稳定的互补DNA(cDNA)。cDNA可通过克隆、PCR和测序等技术研究RNA,因此,逆转录是许多RNA实验工作流程的关键步骤。

本页内容:

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)

在RT-PCR中,通过逆转录(RT)将RNA转化为cDNA,然后通过聚合酶链式反应(PCR)扩增cDNA(图1)。利用cDNA扩增步骤,有望对初始RNA进行进一步研究,即便RNA样本数量有限或低丰度表达。RT-PCR的常见应用包括表达基因检测、转录物变异检测,以及克隆和测序用cDNA模板制备。

Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)
图1. 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。RT =逆转录,RTase =逆转录酶

由于逆转录可为PCR扩增和下游实验提供cDNA模板,因此,它是实验成功的关键步骤之一。选定的逆转录酶应对所有样本均具有最高效率,即便是难转录RNA样本,如降解、抑制剂残留或具有高度二级结构的RNA样本。

一步法和两步法是两种最常用的RT-PCR方法,每种方法都具有各自的优缺点(图2)。顾名思义,一步法RT-PCR在单个反应管中将第一链cDNA合成(RT)和后续PCR反应结合在一起。该反应设置可简化工作流程、减少结果差异,并将污染的可能性降至最低。一步法RT-PCR简化了大量样本的处理,适用于高通量应用。但是,一步法RT-PCR采用基因特异性引物进行扩增,将分析局限于每个RNA样本中的几个基因。由于反应需兼顾逆转录和扩增条件,因此,一步法RT-PCR在某些情况下可能具有较低的灵敏度和效率。但是,在RT-PCR中使用基因特异性引物,有助于最大化目标cDNA的得率,并最小化扩增背景。

两步法RT-PCR包含两个独立反应,首先进行第一链cDNA合成(RT),然后在单个反应管中通过PCR扩增第一步骤中所得cDNA。因此,两步法RT-PCR可用于检测单个RNA样本中的多个基因。RT和PCR反应独立进行,可对每个步骤的反应条件进行优化,使逆转录引物选择(oligo(dT)引物、随机六聚体或基因特异性引物)和PCR反应建立(如DNA聚合酶选择和PCR组分)更灵活。与一步法RT-PCR相比,两步法RT-PCR的缺点包括多个步骤延长了工作流程、增加样本处理和操作步骤以及提高污染和结果变异的可能性。

表1. 对比一步法和两步法RT-PCR

  一步法RT-PCR 两步法RT-PCR
反应建立 在同时支持逆转录和PCR的条件下,将两个反应结合在一起 单独优化的逆转录和PCR反应
引物 基因特异性引物 oligo(dT)、随机六聚体或基因特异性引物
最佳用途 分析一种或两种基因;高通量平台 分析多种基因
优势 方便,高通量 灵活

定量RT-PCR(RT-qPCR)

定量RT-PCR(RT-qPCR)的最常见应用之一是通过对细胞和组织一段时间或事件后(如,药物治疗)实时mRNA水平的定量分析。RT-qPCR比RT-PCR的灵敏度更高,因此,RT-qPCR也常用于检测研究样本中是否存在逆转录病毒(RNA病毒)。与RT-PCR工作流程相似,RT-qPCR首先将RNA转化为cDNA,然后进行PCR扩增。主要区别在于,RT-qPCR在扩增对数期通过荧光法测定扩增cDNA的水平。扩增水平是对RNA中初始靶标进行定量的基础。(了解关于定量PCR的更多信息

RT-qPCR基因表达定量的准确性在很大程度上取决于cDNA模板的质量和数量。因此,逆转录对于RT-qPCR的成功至关重要。逆转录步骤应产生可代表初始RNA的cDNA产物。因此,所选择的逆转录酶应该具有有效合成cDNA的能力,即使是对低丰度基因以及次优质和/或难转录RNA样本(即富含GC、存在抑制剂或降解RNA样本)。(了解有关逆转录酶属性的更多信息)

除高效逆转录酶之外,在选择逆转录反应试剂方面还需要考虑很多因素。首先,在宽的RNA起始量范围内,cDNA的动态范围或线性扩增是至关重要的。使cDNA得率与RNA起始量成正比,可确保基因表达定量的准确性(图3)。

linearity-of-qpcr-results
图3.在总RNA起始量范围内,使用逆转录预混液检测(A)高丰度和(B)低丰度RNA靶标的qPCR线性结果。RNA起始量范围为10 pg至1μg,依次进行逆转录和PCR扩增。两种预混液均产生与RNA起始成比例的cDNA,但是预混液1具有较低(即较早)的Ct,得率较高,特别是对低丰度基因靶标。

此外,所选试剂在扩增过程中应产生较高且一致的cDNA得率,以获得具有高灵敏度和低变异性的基因表达结果(图4)。单管预混液含有逆转录所需的所有必需组分,有助于将实验变异、交叉污染和移液误差降至最低。(了解有关最佳RT-qPCR逆转录酶的更多信息

Sensitivity and variability of qPCR results subsequent to using different RT master mixes
图4.使用不同逆转录预混液检测(A)高丰度和(B)低丰度RNA靶标所得qPCR结果的灵敏度和变异性。在这些试剂中,使用预混液1进行30次重复实验所得结果具有最低的平均Ct值和标准偏差,表明逆转录试剂的选择对于获得可靠的基因表达分析结果非常重要。

RT-qPCR的一个特殊程序是从未经RNA分离的粗细胞裂解物直接进行逆转录[1]。在重点关注稀有细胞或事件的实验中,如使用稀缺样本或选用群体内特定细胞的实验,可考虑使用直接RT-qPCR法来防止可能的样本损失和低RNA回收。在直接RT-qPCR过程中,在细胞裂解过程中抑制可降解RNA的内源性RNA酶和去除细胞基因组DNA是至关重要的步骤。利用优化试剂盒,只需7分钟即可完成样本制备,同时提供来自单个细胞的信号。具有高持续合成能力的逆转录酶具有抑制剂抗性和高灵敏性,特别适用于未纯化RNA提取物的逆转录。

cDNA克隆和文库构建

逆转录酶在分子生物学中的首要应用之一是构建cDNA文库[2-4]。cDNA文库由可代表特定样本中转录序列的cDNA克隆组成。因此,文库提供了关于特定细胞类型、器官或发育阶段的基因时空表达信息。cDNA文库克隆可用于鉴定新型RNA转录物、测定基因序列和重组蛋白的表达。

构建cDNA文库的必要条件是RNA可适当代表其全长和/或相对丰度,因此,逆转录酶的选择非常重要。具有高持续合成能力的逆转录酶可以合成长cDNA,并捕获低丰度RNA。同样,在对具有高度二级结构的RNA进行逆转录时,建议使用热稳定性较强的逆转录酶。(了解关于逆转录特点的更多信息

在逆转录后,有多种方法可以将cDNA插入克隆载体。第二链合成后获得的双链cDNA通常具有钝端,可以克隆到平末端载体中(图5A)。虽然平末端克隆所含步骤较少,但这种方法可能具有较低的插入效率,并导致插入后的方向性丧失。(了解有关克隆工作流程的更多信息

或者,可通过修饰在cDNA末端添加具有已知序列的其他核苷酸。例如,为修饰cDNA的5'末端,可使用具有附加5'核苷酸的oligo(dT)引物启动逆转录;为修饰3'末端,可以连接具有目标序列短DNA寡核苷酸(被称为接头或接头)(图5B)。通过这种方式,可将定向插入位点(如限制性和同源重组)、启动子结合(如,T3和T7序列)和亲和纯化(如,生物素和His标签)轻松整合到cDNA序列中。(了解关于DNA文库构建的更多信息

在另一种常用方法中,使用互补同聚物尾部结构使cDNA插入片段和载体的3'末端酶促延伸。使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和单个dNTP,可以在插入片段上添加一串含20-30个核苷酸的序列,并将一串相似的互补核苷酸添加到载体上(如,插入片段上的Cs和载体上的Gs),使载体和插入片段尾部相互退火(图5C)。在转化后,细菌内的间隙被修复,因此不需要连接步骤。

若目标序列是已知的,可通过RT-PCR生成插入片段,用于克隆cDNA的特定区域(图5D)。(了解关于PCR克隆的更多信息

cDNA末端快速扩增(RACE)

cDNA末端快速扩增(RACE)是一种基于PCR的方法,可用于确定cDNA 5'和3'末端的未知序列[5]。通常,这些方法分别被称为5' RACE和3' RACE。RACE的实验目标包括鉴定5'和3'非翻译区、研究异质性转录起始位点、表征启动子区域、测定完整cDNA序列以及用于蛋白质表达的完整开放阅读框(ORF)的测序。

使用具有单侧特异性的PCR(也称为单侧或锚定PCR [6,7])扩增cDNA的未知区域,用作RACE产物。5' RACE通过延伸具有寡核苷酸的5'末端进行PCR引物结合,而3'RACE利用mRNA的poly(A)尾部结构作为PCR的通用引物位点(图6)。

在5' RACE(图6A)中,使用基因特异性引物,将特定序列或相关家族的mRNA逆转录到第一链cDNA中。然后,使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)在cDNA 3'末端添加一个同聚物尾部结构(通常是一串Cs),或将cDNA 3'末端连接到寡核苷酸接头上。随后,进行两轮半嵌套PCR,以扩增具有5'未知序列的区域。PCR还可通过下游应用的引物延长扩增子,如定向克隆的限制性位点引入和用于测序的通用测序引物结合位点。

在3′ RACE(图6B)中,使用具有接头序列的oligo(dT)引物将mRNA逆转录成cDNA。然后,使用已知上游外显子序列的特异性引物和通过oligo(dT)引物引入的接头序列,进行两轮半嵌套PCR。通过这种方式,可对外显子和poly(A)尾部结构之间的未知3´ mRNA序列进行扩增,以用于进一步分析。

起始RNA的质量和逆转录反应的设置对于成功完成RACE实验至关重要。在5'RACE中,任何长度的(甚至包括未到达mRNA 5'末端的)第一链cDNA都将具有添加序列(即同聚物尾部结构或接头),随后通过PCR进行扩增。为了最大化全长cDNA的合成,应选择具有最小RNA酶H活性、高持续合成能力和高热稳定性的逆转录酶。(了解有关逆转录酶特点的更多信息

或者,设计可结合到mRNA 5'末端附近的基因特异性引物,缩短cDNA合成期间与逆转录之间的距离,将有助于捕获未知的5'末端序列。同样,可以考虑在逆转录中选用具有5'-7-甲基鸟苷(7mG)帽子结构的RNA(代表成熟全长真核mRNA)进行程序修饰(图7)[8,9]。

在3'RACE中,全长cDNA并不重要,因为不会扩增PCR起始位点的上游序列。但是,最好选用可生成长cDNA的逆转录酶,因为没有到达PCR引物结合位点的cDNA不会出现在RACE分析中。

基因表达芯片

在20世纪90年代,DNA芯片的发展开辟了大规模无偏差或先前假说的基因表达图谱分析。芯片由玻璃或硅晶片上数千个被称为“features”或“spots”的腔室组成。每个腔室的表面上固定有相同拷贝数的单链DNA序列,称为“探针”,每个探针代表一个基因。探针与用于微阵列的荧光标记cDNA靶标杂交,可同时比较两个样本之间的基因表达(图8和9)[10-12]。

Gene expression microarray chip
图8. 基因表达微阵列芯片

微阵列探针由生物体基因组或cDNA的已知序列生成。例如,可以利用PCR对每个已知基因进行扩增,然后将其产物变性为单链DNA,并将其固定到芯片上作为探针。或者可直接在芯片上合成20-60nt寡核苷酸,作为芯片探针[13]。

图9概述了如何将基因芯片用于不同样本的基因表达分析。首先,从两个实验(也称为“测试”或“处理”)样本和对照(也称为“参考”或“正常”)样本中分离总RNA或mRNA。然后,将纯化的RNA样本转化为cDNA,并用不同的荧光染料标记。接下来,将两个样本的标记cDNA靶标混合,并与一个微阵列芯片上的探针杂交。洗去未结合的靶标,扫描芯片以检测标记的荧光基团。然后,分析两种荧光信号的比例,从而量化受实验条件影响的基因的表达。

cDNA靶标可在逆转录过程中或之后进行标记(图10)。若采用直接标记,则在cDNA合成期间掺入荧光标记的核苷酸。或者若采用间接标记,可使用修饰的核苷酸进行逆转录,然后使用荧光基团标记cDNA。虽然间接方法需要更长的工作流程,但荧光标记往往更高效[14]。

当RNA起始量较少时(如10-100ng),可以使用T7-oligo(dT)启动子引物将RNA逆转录为双链cDNA。随后,通过体外转录扩增cDNAs(图11)。在体外转录过程中,可以使用修饰的核糖核苷酸直接或间接标记RNA。或者,对扩增的RNA进行逆转录和标记,生成cDNA靶标[15]。

Amplification of RNA by conversion to cDNA followed by in vitro transcription from an added promoter sequence

图11. 通过将RNA转化为cDNA并从附加启动子序列进行体外转录,实现RNA扩增。

在选择逆转录酶以制备用于基因芯片实验的cDNA靶标时,获得高产量全长cDNA的能力对于良好覆盖RNA来说至关重要,包括富含GC或具有二级结构的RNA序列。同样重要的是,为确保获得高信噪比,逆转录酶必须能够有效整合修饰的核苷酸,从而能够准确且无偏差地检测输起始RNA。(了解有关逆转录酶属性的更多信息

RNA测序(RNA-Seq)

RNA测序,又称为RNA-Seq,通常可用于研究从基因组转录的RNA及其调控作用。随着二代测序(NGS)的出现,RNA-Seq已经成为用于分析全转录组(即转录的编码和长非编码RNA)、测定基因表达、发现剪接变异和融合转录物以及检测低丰度基因的的高通量方法[16,17]。与基因芯片相比,RNA-Seq的优点包括动态范围更大、灵敏度更高以及可在无基因组信息的情况下表征RNA序列。

由于大多数测序平台是为DNA设计的,因此,RNA-Seq模板制备需要进行逆转录。最好的结果是所得cDNA能够无偏差代表初始RNA,包括低丰度转录物。全长cDNA合成对于捕获样本中的所有RNA序列也很重要。逆转录的错误率非常关键,其取决于序列文库的大小和数据质量。因此,应认真选择逆转录酶。(了解有关逆转录酶特点的更多信息

研究目标和测序技术将决定RNA-Seq模板制备的顺序和方法[18,19]。生成测序文库的标准工作流程包括富集目标RNA、RNA或cDNA片段化、逆转录、测序接头的添加(在多重测序中,还需添加索引或条形码),以及可选的文库PCR扩增(图12)。

Traditional workflow of RNA sequencing
图12. RNA测序的传统工作流程。

为了富集mRNA样本,通常需要从样本中去除构成总RNA约80%的核糖体RNA(rRNA),以改善转录组的测序数据。Poly(A)尾部结构通常存在于真核mRNA和长非编码RNA中,所以具有共价结合oligo(dT)的磁珠成为有效富集这些mRNA的替代方法。相比之下,rRNA去除是富集原核mRNA的优选方法,因为原核mRNA不具有可用于分离的Poly(A)尾部结构。对于小RNA(<200nt)来说,可以选用分子量筛选特殊分离方法

根据实验目标和测序平台,可选择在逆转录前或逆转录后(即在RNA或双链cDNA上)进行片段化处理。为兼容NGS技术,应制备200-500 nt的片段,以确保高质量读取。片段化方法包括机械法(如超声处理,雾化)、化学法(如水解)和酶促法(如RNase III、DNase I)。

为了检测转录物的方向或正义/反义性(称为“链型”),可以在逆转录之前处理RNA片段,例如使用不同接头标记末端。或者,可在第二链cDNA合成中使用dUTP,从而特异性标记第一链cDNA的互补链(图13)[20]。

Strand-specific&#x20;RNA&#x20;sequencing
图13. 链特异性RNA测序。

片段末端的接头序列可作为与测序平台的连接物。在cDNA合成或扩增过程中,可直接添加或通过特殊设计的引物添加这些接头。除接头外,可以通过PCR加入条形码或索引序列,从而同时对多个样本进行测序(多重测序)。当RNA起始量较低时,PCR有助于生成足够量的输入cDNA用于测序。(了解有关PCR测序的更多信息

对于测序分析,可使用基因组导向方法或从头方法产生逆转录数据,具体取决于可用的参考基因组类型。基因组导向方法将测序结果映射到已知的基因组序列,而从头方法通过片段重叠组装而得出结果,后者需要大量的计算能力[21]。(了解有关鸟枪法测序的更多信息

如本节所述,逆转录是cDNA应用工作流程的组成部分。选择最适合您的研究目标的逆转录方法和酶,对于获得成功的实验结果至关重要。

参考文献

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