GeneOptimizer 成功优化基因的流程

定制基因合成的强大之处在于,可以根据您的需求设计自己的DNA,无需受到传统克隆方法的局限。但对于大多数研究人员而言,同样重要的是要通过合成基因获得高产量的mRNA,并最终获得更高产量的蛋白。为了最大限度提高所有现有表达体系的合成基因表达水平,我们开发了GeneArt™ GeneOptimizer™软件。在每个GeneArt项目中,均可选择进行系列优化。

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我们的工作不仅是优化密码子

什么是基因优化

基因优化充分利用了基因密码简并的优势。由于简并,一个蛋白可由多种核酸序列编码。密码子偏好(密码子选择)因不同的生物体而异,其会造成难以在异源表达体系中表达重组蛋白,进而造成表达率低、不可靠。自体表达也可能存在这种问题,因为野生型序列不仅需要对表达产量进行优化,还要优化降解、调控和其他性质。

即便如此,密码子优化也不是有效蛋白表达的唯一关联因素。

我们的 GeneOptimizer算法可实现真正的多参数优化,处理大量涉及基因表达多方面内容的序列相关参数,如转录、剪接、翻译和mRNA降解。其在单次运算中考虑到了所有的相关优化参数,可为你提供依据您的技术规格设计、为最大限度发挥您的体系性能而优化的DNA序列。(表 1)。

理性权衡优化参数组合(例如,密码子调整、mRNA从头合成及稳定性,转录和翻译效率)对于实现指定蛋白最高效率表达非常重要。

1+Transcription Translation

图1:蛋白表达演示图。


表1:影响蛋白表达的参数。
转录水平 mRNA水平 翻译水平
  • GC含量
  • 共有剪接位点
  • 隐蔽剪接位点
  • SD序列
  • TATA框
  • 终止信号
  • 人工重组位点
  • RNA不稳定性基序
  • 核糖体进入位点
  • 重复序列
  • 密码子使用
  • 未成熟的poly(A)位点
  • 核糖体进入位点
  • 二级结构

合成序列的另一个优势是,您不必依赖现有的DNA模板,可以根据自己的要求精确设计序列。可以根据需要添加或去除限制位点、启动/停止密码子、标签和其他基序。

采用GeneOptimizer软件进行序列优化是GeneArt™基因合成和DNA片段服务的一个可选步骤。为了充分利用这一服务,在通过我们的在线客户主页定制请求时,请选择您的表达宿主。该在线软件随即引导您完成整个项目设计流程,包括序列优化。至于如下所述的最终优化性能,不过是GeneArt DNA 提供的额外附加价值之一。

它的工作原理是什么?

通过我们的在线客户主页,可在几分钟内轻松采用GeneOptimizer技术进行基因优化。您可上传自己的序列、选择表达体系、指定克隆载体和序列详情(包括开放读取框、未翻译区域以及克隆位点),设计自己的合成基因。提交您的请求后,GeneOptimizer会根据与指定宿主生物相关的所有参数考量以及您的单独序列要求,生成最符合您的研究需求的 DNA 序列。

有效性验证

我们已经进行了若干项内部研究,许多客户报告显示, GeneArt密码子和序列优化在不损失蛋白功能的情况下,实现了更高的蛋白表达。

在首个此项研究中[1],我们选择了五个重要的蛋白分类进行优化:蛋白激酶、转录因子、核糖体蛋白、细胞因子和膜蛋白。随后从 NCBI 数据库中选择了50个人类基因来表达五种蛋白类别。 选定的基因采用 GeneOptimizer算法进行单独优化[2]。为了进行比较,通过NCBI数据库提供的天然序列,对相应的野生型基因进行亚克隆。随后每种基因在HEK293T细胞中表达三次。优化之后,50个基因均表现出了可靠表达,86%表现出了更高的表达(图2中的实例)。后续的分析表明,蛋白可溶性和功能性未发生实质性变化,如JNK1、JNK3和CDC2所示(未显示相关数据)。

本研究中使用的 GeneOptimizer 算法的结果是:

  • 86%的优化基因表现出了蛋白表达水平激增
  • 优化基因的蛋白产量提高达15倍
  • 优化基因100%表达,而野生型基因进行88%表达
CO34472-fig4

图 2:代表不同蛋白类别的野生型和优化基因的表达分析结果比较。 (A)采用抗His抗体,通过免疫印迹法分析细胞培养上清(分泌型蛋白)或细胞裂解物。图示为每种蛋白类别的一个实例。用60kDa蛋白使蛋白量标准可测,包含在空白载体阴性对照中。各图左侧:分子量值(kDa)。图右侧:特定蛋白条带的标识符。(B)野生型或优化结构的相对表达水平(三次独立转染的平均值)。显示了优化结构的各种蛋白表达量增加倍数。采用野生型构造体,未检测到IL-2表达。(图片摘自Fath et al., 2011 [1])。

图3:展示的另一则实例, 在通过GeneOptimizer软件优化序列后,HIV gag蛋白的mRNA和蛋白产量均观测到增加。

 mRNA and protein yields of the HIV gag protein

图 3:展示的另一则实例, 在通过GeneOptimizer软件优化序列后,HIV gag蛋白的mRNA和蛋白产量均观测到增加。转染COS7、CHO和HeLa细胞后,获得了与此相似的结果。此研究在雷根斯堡大学医院R.Wagner小组内进行[3]。


为了展示GeneOptimizer软件的指标,我们比较了不同供应商优化序列的蛋白表达水平。选择三种人类激酶的基因优化和合成,或者采用五种其他供应商进行类似的优化和合成。HEK293细胞的三次表达研究表明,GeneArt优化不仅表达水平高于野生型基因,且在各种条件下的性能均优于五种其他供应商的优化算法(图4)。

Expression levels from wild type genes

图4:野生型基因,以及GeneArt技术和五种其他供应商优化的同一基因的表达水平。 相对蛋白表达值是以GeneArt序列为标准的。

参考文献

  1. Fath et al.: Multiparameter RNA and Codon Optimization
  2. Raab et al.: The GeneOptimizer algorithm: using a sliding window approach to cope with the vast sequence space in multiparameter DNA sequence optimization
  3. Graf et al.: Codon-Optimized Genes that Enable Increased Heterologous Expression in Mammalian Cells and Elicit Efficient Immune Responses in Mice after Vaccination of Naked DNA

在线索取更多有关 GeneArt 优化和我们的基因合成服务的信息,或发送邮件至geneartsupport@thermofisher.com

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文献

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