定向TOPO克隆利用5分钟的连接反应,按5´→3´方向将平末端PCR产物直接克隆到表达载体中,从而避免了亚克隆步骤,且节省了时间。

定向TOPO克隆载体的5´端为单链GTGG突出端,3´端为平末端。 The four-nucleotide overhang invades the double-strand DNA of the PCR product and anneals to the CACC sequence that you place in your 5´ primer. 随后,拓扑异构酶 I 按正确的方向连接 PCR 产物。

使用定向TOPO克隆试剂盒,您可以:

  • 节省时间——只需五分钟即可完成PCR产物的TOPO 克隆
  • Obtain efficient cloning results - recombinant clones (>90%) will be in the correct orientation for expression (Figure 1)
  • 实现高水平表达——载体带有功能强大的启动子,可用于大肠杆菌或哺乳动物细胞的表达

图1: 将人开放阅读框定向克隆至pcDNA 3.1 D/VS- His- TOPO载体内。