Ambion Cells-to-CT Kits

Cells-to-CT试剂盒使您不需进行RNA纯化就能直接从细胞中得到实时定量RT—PCR结果。 这些试剂盒提供了无与伦比的基因表达和microRNA分析性能,包括siRNA诱导的mRNA敲除检测。Cells-to-CT试剂盒适用于TaqMan方法和SYBR Green方法。

  • 极其简单且快速——一般在10分钟内完成96个样本的制备用于RT-qPCR
  • 无需繁琐的RNA纯化——无需使用分离柱、加热、离心或样本转移
  • 出众的性能——可以从10–100,000个细胞中获得一致的准确性、可重复性和灵敏度
  • 已经过验证的优质试剂盒工作流程——已经过预先优化的全套高效试剂,即取即用

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1步法还是2步法qRT-PCR

您可以选择1步法试剂盒:

  • 有许多样本,样本有一个或多个靶点
  • 不保存cDNA
  • 使用移液机器人

选择2步法试剂盒:

  • 您需要更高的灵敏度检测稀有转录本
  • 可以长期保存cDNA
  • 定量cDNA中的多个靶点
  • 使用移液机器人

选择1步法还是2步法qRT-PCR试剂盒的更多因素


TaqMan 还是 SYBR Green方法?

Taqman检测通常提供更短的实验流程、更高的特异性和灵敏度,并且具有可进行多重检测的能力。SYBR Green 染料法由于引物的选择范围更广,常被认为具有更好的灵活性,且成本通常较低。

了解更多如何选择一个检测方法


Cells-to-CT试剂盒选择指南

  Fast Advanced Cells-to-CT kits Cells-to-CT kits
完整的实验流程 Lysis → RT → qPCR
Cells-to-CT裂解, DNase和终止液 Yes
检测方法 SYBR Green 形式* TaqMan 形式** SYBR Green 形式* TaqMan 形式**
获得最终结果时间 95 min 80 min 120 min
工作范围 10–100,000 个细胞 10–100,000 个细胞
特异性 中† 中†
灵敏度(可以加入qPCR反应的样本比例) 13.5%裂解液 20%裂解液 13.5%裂解液 20%裂解液
可重复性 中† 中†
多重        
预设计实验        
需要使用人设计,实验优化        
基因表达 中等水平定量 高等水平定量 中等水平定量 高等水平定量
应用
  • 基因表达
  • DNA 定量
  • CHiP
  • SNP 分型
  • 拷贝数变异
  • 通路分析
  • microRNA和小RNA
  • 突变检测
  • 多重检测
  • 基因表达
  • DNA定量 (病原体检测)
  • CHiP
  • 基因表达
  • DNA定量
  • CHiP
  • SNP基因分型
  • 拷贝数变异
  • 通路分析
  • microRNA和小RNA
  • 突变检测
  • 多重分析
检测
  • SYBR Green引物
  • SYBR Green预混液
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  • TaqMan分析试剂
  • TaqMan预混液

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  • SYBR Green引物
  • SYBR Green预混液
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  • TaqMan分析试剂
  • TaqMan预混液

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* 基于SYBR Green的检测采用SYBR Green染料 (dsDNA结合染料) 来检测PCR过程中积聚的PCR产物。
** 基于TaqMan的检测使用目的基因特异性的荧光探针来检测PCR过程中积聚的靶点。
† 基于SYBR Green的分析需要设计并验证引物,以确保特异性。特异性和可重复性取决于模板质量及引物设计和优化。

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  Cells-to-C1-Step TaqMan Kit Cells-to-CT 1-Step Power SYBR Green Kit
  1步法qPCR 样本制备 1步法qPCR 样本制备
检测方法 TaqMan SYBR Green
特异性 中*
裂解步骤的细胞数目 10–100,000 个细胞 10–100,000 个细胞
检测灵敏度 1–10 拷贝数 可变的*
可重复性 中*
需要RNA纯化 No No
8个样本的制备时间(to qRT-PCR) 7 min 7 min
总时间 (从细胞裂解到qRT-PCR 结果) 35 min 1 hr 23 min
多重分析    
cDNA 收集保存    
包括RT酶和预混液    
包括预扩增试剂    
可用于高通量    
灵活性
  立即订购
  Single Cell-to-CqRT-PCR Kit
  Single Cell-to-CT Kit
检测方法 TaqMan
特异性
裂解步骤的细胞数目 1–10 个细胞
检测灵敏度 1–10 copies
可重复性
需要RNA纯化 No
8 个样本的制备时间 (to qRT-PCR) 7 min
总时间 (从细胞到qRT-PCR) 3 hr
多重qPCR  
cDNA收集保存  
包括RT酶和预混液  
包括预扩增试剂  
可用于高通量  
灵活性

* 取决于模板质量和因无/设计优化。

  Fast Advanced Cells-to-CT kits Cells-to-CT kits
完整的实验流程 Lysis → RT → qPCR
Cells-to-CT裂解, DNase和终止液 Yes
检测方法 SYBR Green 形式* TaqMan 形式** SYBR Green 形式* TaqMan 形式**
获得最终结果时间 95 min 80 min 120 min
工作范围 10–100,000 个细胞 10–100,000 个细胞
特异性 中† 中†
灵敏度(可以加入qPCR反应的样本比例) 13.5%裂解液 20%裂解液 13.5%裂解液 20%裂解液
可重复性 中† 中†
多重        
预设计实验        
需要使用人设计,实验优化        
基因表达 中等水平定量 高等水平定量 中等水平定量 高等水平定量
应用
  • 基因表达
  • DNA 定量
  • CHiP
  • SNP 分型
  • 拷贝数变异
  • 通路分析
  • microRNA和小RNA
  • 突变检测
  • 多重检测
  • 基因表达
  • DNA定量 (病原体检测)
  • CHiP
  • 基因表达
  • DNA定量
  • CHiP
  • SNP基因分型
  • 拷贝数变异
  • 通路分析
  • microRNA和小RNA
  • 突变检测
  • 多重分析
检测
  • SYBR Green引物
  • SYBR Green预混液
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  • TaqMan分析试剂
  • TaqMan预混液

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  • SYBR Green引物
  • SYBR Green预混液
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  • TaqMan分析试剂
  • TaqMan预混液

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* 基于SYBR Green的检测采用SYBR Green染料 (dsDNA结合染料) 来检测PCR过程中积聚的PCR产物。
** 基于TaqMan的检测使用目的基因特异性的荧光探针来检测PCR过程中积聚的靶点。
† 基于SYBR Green的分析需要设计并验证引物,以确保特异性。特异性和可重复性取决于模板质量及引物设计和优化。

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  Cells-to-C1-Step TaqMan Kit Cells-to-CT 1-Step Power SYBR Green Kit
  1步法qPCR 样本制备 1步法qPCR 样本制备
检测方法 TaqMan SYBR Green
特异性 中*
裂解步骤的细胞数目 10–100,000 个细胞 10–100,000 个细胞
检测灵敏度 1–10 拷贝数 可变的*
可重复性 中*
需要RNA纯化 No No
8个样本的制备时间(to qRT-PCR) 7 min 7 min
总时间 (从细胞裂解到qRT-PCR 结果) 35 min 1 hr 23 min
多重分析    
cDNA 收集保存    
包括RT酶和预混液    
包括预扩增试剂    
可用于高通量    
灵活性
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  Single Cell-to-CqRT-PCR Kit
  Single Cell-to-CT Kit
检测方法 TaqMan
特异性
裂解步骤的细胞数目 1–10 个细胞
检测灵敏度 1–10 copies
可重复性
需要RNA纯化 No
8 个样本的制备时间 (to qRT-PCR) 7 min
总时间 (从细胞到qRT-PCR) 3 hr
多重qPCR  
cDNA收集保存  
包括RT酶和预混液  
包括预扩增试剂  
可用于高通量  
灵活性

* 取决于模板质量和因无/设计优化。

全新的Invitrogen Fast Advanced Cells-to-CT试剂盒利用实时荧光定量RT-PCR (RT-qPCR) 直接从培养的细胞样本中检测相对基因表达,使研究人员能够完全省去RNA纯化步骤。Cells-to-CT试剂盒提供TaqMan和SYBR Green两种形式,提高了灵活性。这些试剂盒可提供从培养细胞直接进行RT-qPCR分析的完整工作流程,无需RNA纯化。该试剂盒采用独特的方法裂解培养细胞,同时去除基因组DNA (gDNA) 并保持RNA完整性,其包含逆转录 (RT) 试剂用于cDNA合成,以及TaqMan或SYBR Green预混液用于实时荧光定量PCR分析。

有两种形式可供选择,提高了灵活性

全新的TaqMan Fast Advanced Cells-to-CT试剂盒采用了改进的逆转录酶,可以更灵敏地检测高丰度或稀有转录本。这样无需RNA纯化即可直接使用培养细胞进行表达分析。该试剂盒有助于节省时间,提供了适用于少量样本的简单工作流程,也可轻松整合至自动化的高通量应用中。

TaqMan Fast Advanced Cells-to-CT试剂盒可提供:

  • 与早期的TaqMan基因表达Cells-to-CT试剂盒相同的专利裂解液和终止液
  • 出众的靶点检测特异性
  • 极其简单且快速——一般在10分钟内完成96个样本的RT-PCR
  • 无需繁琐的RNA纯化——无需使用分离柱、加热、离心或样本转移
  • 出众的性能——可以从10–100,000个细胞中获得一致的准确性、可重复性和灵敏度
  • 已经过验证的优质试剂盒工作流程——已经过预先优化的全套高效试剂,即取即用
  • 超过200万种预设计分析,几乎可检测任何基因产物
  • 经济实惠的分析,几乎涵盖了RefSeq数据库中的人、小鼠和大鼠的每个基因
  • 覆盖28个种属以及一些病原体

全新的SYBR Green Fast Advanced Cells-to-CT试剂盒采用了一种快速、简单且可靠的方法,直接从培养细胞中获取实时荧光定量PCR结果。这种成熟的细胞裂解和RNA稳定技术省去了耗时费力的RNA纯化过程。该试剂盒采用Applied Biosystems AmpliTaq Gold DNA聚合酶, LD (低DNA),可提供最高水平的标准实时荧光定量PCR特异性。

The SYBR Green Fast Advanced Cells-to-CT试剂盒可提供:

  • • 与早期的TaqMan基因表达Cells-to-CT试剂盒相同的专利裂解液和终止液
  • • 较高的靶点检测特异性
  • • 极其简单且快速——一般在10分钟内完成96个样本的RT-qPCR
  • • 无需繁琐的RNA纯化——无需使用分离柱、加热或离心
  • • 出众的性能——可以从10–100,000个细胞中获得一致的准确性、可重复性和灵敏度
  • • 已经过验证的高效试剂盒工作流程——已经过预先优化的全套高效试剂,即取即用

在更短的时间内获得更高的灵敏度

Cells-to-CT终止液可以增加下游RT和qPCR反应的样本量,极大地提高了稀有靶点检测的灵敏度。TaqMan和SYBR Green Fast Advanced Cells-to-CT试剂盒均使用终止液,采用极其快速的工作流程,提供了极佳的灵敏度。这些试剂盒较绝大多数高通量的RNA纯化试剂盒快约48倍。Fast Advanced Cells-to-CT试剂盒可以一次处理96或384个孔;一块96或384孔板的实验流程仅需10分钟。其他供应商产品的工作流程使用较低的pH和稀释度,限制了下游步骤中可以使用的细胞裂解液的量。

基因表达实验流程比较

基因表达实验流程比较

图1:工作流程中每个步骤的裂解液或RT反应产物体积。 Real-time ready kits are the main competition for our current Cells-to-CT portfolio.

基因表达实验流程

 The procedure for Fast Advanced Cells-to-CT kits is a 2-step process that involves reverse transcription and qPCR following cell lysis

图2:Fast Advanced Cells-to-CT试剂盒采用了2步法流程,在细胞裂解后进行逆转录和qPCR。1步法反应是在单个孔内完成RT和qPCR。在qPCR步骤中,TaqMan分析使用针对每个靶点设计的定制引物和探针组合。它们较采用通用qPCR引物的SYBR Green分析更灵敏且特异。

Cells-to-CT试剂盒可提供从培养细胞直接进行RT-qPCR分析的完整工作流程,无需RNA纯化。该试剂盒采用独特的方法裂解培养细胞,同时去除基因组DNA (gDNA) 并保持RNA完整性,其包含逆转录 (RT) 试剂用于cDNA合成,以及TaqMan或SYBR Green预混液用于实时荧光定量PCR分析。

1步法和2步法试剂盒的区别在于,1步法试剂盒将逆转录和real-time PCR融合成一个步骤,显著减少了移液步骤和实验操作时间。

不论你是使用孔板还是塑料管,Cells-to-CT试剂盒都可以使用简单的7-8分钟的样本制备流程,如下方所示(图2)。裂解技术设计用于处理单个样本中的10-100,000个培养细胞。细胞先用PBS清洗,再置于室温裂解5分钟。同时进行DNase处理。裂解过程在加入终止液,室温孵育2分钟后被终止。裂解液现在已经准备好可以在你的real-time PCR机器上运行或者置于–20°C储存长达5个月。2步法试剂盒流程经过逆转录合成cDNA,之后cDNA样本被收集储存或者直接进行real-time qPCR分析。

由于样本直接在培养孔里被处理(96 or 384孔),样本处理、样本丢失可能性或转移错误被减少,有利于快速高通量检测流程。与传统的多步骤RNA分离步骤不同,你无需加热,无需清洗,无需离心。试剂盒大大简化了耗时费力的30-60分钟流程,将实验压缩到7-8分钟反应时间,使得从处理培养细胞样本开始到qRT-PCR的完整反应时间减少到35分钟(例如,Cells-to-CT 1-Step TaqMan 试剂盒)。

Fast Advanced Cells-to-CT 2步法试剂盒较传统RNA纯化方法更快速、更方便,且不影响灵敏度。由于Cells-to-CT试剂盒工作流程是基于裂解液的,因此无任何RNA损失。在传统的RNA纯化中,由于过滤器或磁珠洗脱不充分,始终会有少量RNA损失。因此,相比使用RNA纯化流程处理的样本,采用Cells-to-CT试剂盒处理时,其检测低细胞水平的样本 (10–1,000) 中的稀有RNA的能力更高。此外,结合终止液的优点,Cells-to-CT工作流程的灵敏度高于竞争厂商的试剂盒,可用于检测高丰度及低拷贝数的转录本。

相比其他试剂盒的灵敏度

图3:相比其他试剂盒的灵敏度。遵照各试剂盒实验方案裂解104个细胞。在每种试剂盒的RT中加入最高量的裂解液 (Cells-to CT和Fast Advanced Cells-to CT试剂盒为45%;其他供应商的产品为10%)。然后将25% RT产物加入TaqMan磷酸二酯酶TaqMan Array的qPCR反应中,使用各试剂盒中的qPCR预混液。Fast Advanced Cells-to CT试剂盒较早期的Cells-to-CT试剂盒平均低0.5 Ct,较其他供应商的试剂盒低3.6 Ct (灵敏度较其他供应商高11倍)。

相比其他试剂盒的灵敏度

图4:相比其他试剂盒的灵敏度。遵照各试剂盒实验方案裂解104个细胞。在每种试剂盒的RT中加入最高量的裂解液 (早期的Cells-to CT和Fast Advanced Cells-to CT试剂盒为45%;其他供应商的产品为10%)。然后将25% RT产物加入磷酸二酯酶TaqMan Array的qPCR反应中,使用各试剂盒中的qPCR预混液。结论:Fast Advanced Cells-to-CT试剂盒较早期的Cells-to-CT试剂盒平均低0.7 Ct,较其他供应商的试剂盒低4.7 Ct。这表示Fast Advanced试剂盒的灵敏度较其他供应商的试剂盒高14倍。

检测比较

图5:检测比较。遵照各试剂盒实验方案裂解104个HepG2细胞。在每种试剂盒的RT中加入最高量的裂解液 (Cells-to-CT和Fast Advanced Cells-to-CT试剂盒为45%;其他供应商的产品为10%)。然后在其他供应商试剂盒的qPCR反应中加入25%的RT产物;在Fast Advanced Cells-to-CT试剂盒的qPCR反应中加入30%,在Power SYBR试剂盒中加入45%。分析10种不同基因。该细胞系中的大部分基因未检测。在大部分的检测基因中,Fast Advanced Cells-to-CT试剂盒的Ct值低于其他试剂盒。

Fast Advanced Cells-to-CT 试剂盒包括一个可以在10分钟内完成96或者384样本制的制备步骤。高通量的RNA分离方法如磁珠试剂盒可以处理384个样本,但是需要3个小时的实验操作时间* 考虑到在一个常规的药物靶点验证筛选实验中,多块96或者384孔板需要被处理。我们比较了处理1536样本(如4 x 384板或16X96孔板)。

  • Cells-to-CT制备1536样本需要40分钟到1小时(如4x384板或16X96孔板)。
  • 磁珠分离流程制备1536样本需要大约48个小时(如16x96孔板,一块板需要3小时)。
  • Cells-to-CT试剂盒快48倍。
Cell-to-CT vs Bead Based Isolation Protocol

* based on the protocol duration of MagMAX mirVana Total RNA Isolation Kit

Cells-to-CT试剂盒的所有组分都被优化用于获得一致和稳定的实验结果。这样可以减少不同样品制备组装阶段和real-time RT-PCR预混液过程涉及到的猜测工作。

Cells-to-CT 1-Step TaqMan试剂盒经TaqMan Gene Expression试剂盒验证,Cells-to-CT 1-Step Power SYBR Green试剂盒经常用基因靶标的一系列引物验证, 两方面的实验结果都证明经过与纯化的RNA具有相同的实验效果,额外的质量保证 (图6)。

TaqMan Gene Expression Cells-to-CT试剂盒比较市售其他裂解试剂盒和纯化RNA进行实验效果对比。每次裂解反应100–100,000起始细胞被检测。TaqMan Cells-to-CT试剂盒和使用纯化RNA的实验流程的获得的灵敏度相同,并且超越了其他供应商的产品(图7)。

Cells-to-CT试剂盒灵敏度

图 6:使用Cells-to-CT试剂盒进行少数靶序列的检测和灵敏度对比。(A)使用裂解液和纯化的RNA进行实验的灵敏度对比。使用Cells-to-CT 1-Step TaqMan试剂盒或者使用RNA分离柱方法纯化HeLa细胞RNA (10–100,000),进行三次平行实验。 每组样品都在7900HT Real-Time PCR系统上运行real-time RT-PCR, 对Cells-to-CT 对照试剂盒中的XENO和ACTB 进行分析。(B) 少数靶标序列的检测。更多的NIH3T3细胞 (小鼠)被加入到 10,000 HeLa 细胞中。使用TaqMan Gene Expression Cells-to-CT试剂盒 (2-步法) 或者使用RNA分离柱方法纯化处理上述样品。所有样本将会在7900HT Fast Real-Time PCR系统上进行小鼠特异性基因(B2M)和人类特异性基因(TKT),进行三次平行实验。

Cells-to-CT试剂盒灵敏度

图7 使用Cells-to-CT试剂盒获得的裂解液TaqMan Gene Expression试剂盒分析获得很好的灵敏度。使用传统RNA纯化方法、Taqman Gene Expression Cells-to-CT试剂盒或其他厂家Q和S的其他裂解方法处理Hela细胞(100-100,000)。每个kit使用最大推荐样品量进行逆转录反应,使用PPIA TaqMan Gene Expression试剂盒进行real-time PCR实验,进行三次平行实验。

为了帮助您体验不同应用程序的强大优化结果,我们还提供实时PCR仪器解决方案,让您的实验工作流程更完整。实时PCR用于核酸靶点的敏感、特异性检测和定量分析。我们已经开发出强大的实验设计算法、优化的预混液、直观的数据分析软件和灵活的仪器,以帮助利用qPCR在丰富和多样化的应用程序上展现强大能力,发现基于qPCR研究的解决方案。

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Cells-to-CT Kits Reviews, Videos & Webinars

Read what scientists have to say about the Cells-to-CT Kits

The TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit has performed consistently. The performance is increased as compared to RNA purification, RT steps, and then qRT-PCR. There is less handling, less chance at mistakes. Because of this time savings and increase in sensitivity, I’ve incorporated this protocol into the Human Embryonic Stem Cell Training Course at the Stem Cell Research Center at Rutgers University.
     
 

—Director, Stem Cell Core Facility

 
 
 
 
Gene expression quantification on cultured cells using the reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) typically involves an RNA purification step that limits sample processing throughput and precludes parallel analysis of large numbers of samples. An approach in which cDNA synthesis is carried out on crude cell lysates instead of on purified RNA samples can offer a fast and straightforward alternative. Here, we evaluate such an approach, benchmarking the Ambion Cells-to-CT kit with the classic workflow of RNA purification and cDNA synthesis, and demonstrate its good accuracy and superior sensitivity.
     
 

—Van Peer G, Mestdagh P, Vandesompele J (2012) Accurate RT-qPCR gene expression analysis on cell culture lysates. Sci Rep 2:222.

 
Videos

How to analyze gene expression from cultured cells

Learn how to prepare RNA for gene expression analysis from cultured cells in 7 minutes.

Webinar

Single cell gene expression profiling in neural stem cells–innovative solutions for sample prep and analysis

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—Director, Stem Cell Core Facility

 
 
 
 
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—Van Peer G, Mestdagh P, Vandesompele J (2012) Accurate RT-qPCR gene expression analysis on cell culture lysates. Sci Rep 2:222.

 
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