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Technologie de plaque de réseau microfluidique
PCR numérique puissante et simple
La compartimentation est la base de la PCR numérique
Lors de son lancement en 1988, une plaque à 384 puits a été utilisée pour démontrer les principes de “limitation de la dilution” pour la détection de cibles rares (1). L’amplification et la quantification de l’ADN à l’aide de la PCR numérique (dPCR) ont évolué, tout comme les méthodes de compartimentalisation ou de distribution de réactifs. L’une des méthodes les plus courantes disponibles aujourd’hui consiste à utiliser la technologie microfluidique pour créer de nombreuses petites réactions isolées par émulsification en gouttelettes. Cela permet de générer des dizaines de milliers de gouttelettes désormais beaucoup plus petites par réaction dPCR. L’augmentation du nombre de gouttelettes améliore la capacité à détecter des cibles rares ainsi que la précision pour des cibles de concentration plus élevée et augmente essentiellement la plage dynamique (2,3).
PCR numérique précise et exacte
Le système de PCR numérique Applied Biosystems QuantStudio Absolute Q repose sur sa technologie de plaque de réseau microfluidique (MAP) exclusive pour obtenir des résultats de dPCR très précis. Fonctionnement :
La MAP (Figure 1) comporte 16 unités de réaction dPCR, facilement différenciées sous forme de carrés opaques. En y regardant de plus près, chaque unité de réaction dPCR (carré opaque) est composée de 20 480 micro-chambres à réseau fixe. Les micro-chambres elles-mêmes sont reliées par un réseau de distribution utilisé pour distribuer des réactifs PCR. Une fois que les réactifs ont été compartimentés dans les micro-chambres, l’amplification par PCR se produit et le nombre de micro-chambres présentant une amplification de l’ADN réussie est compté.
Plus grande constance que les autres méthodes dPCR
Certaines technologies de PCR numérique à gouttelettes (ddPCR) ou émulsion souffrent d’un manque de constance dû à la dépendance à un processus stochastique inhérent, le cisaillement liquide, pour créer des compartiments individuels. Cela peut entraîner une très grande variabilité du nombre total de compartiments générés par réaction dPCR.
En revanche, la technologie MAP QuantStudio Absolute Q ne repose pas sur le cisaillement liquide utilisé dans les gouttelettes ou un déplacement physique de réactifs en excès pour former des compartiments ou des micro-chambres. Ainsi, en plus de fournir une constance supérieure, une réduction du gaspillage de réactifs et un flux de travaux simplifié, la technologie MAP offre une plus grande précision de volume globale, un plus grand nombre de micro-chambres générées et une quantification plus précise.
Présentation des données…
Pour démontrer le type de données générées par la plaque MAP16 sur le système QuantStudio Absolute Q, nous avons eu recours à un dosage multiplex qui utilise les quatre canaux optiques du système QuantStudio Absolute Q pour détecter la cible 1 (FAM), la cible 2 (VIC), la cible 3 (ABY) et la cible 4 (CY5). La Figure 2 montre les tracés de fluorescence dPCR obtenus et les cartes de positivité des micro-chambres générées par le logiciel d’analyse QuantStudio Absolute Q à partir d’une seule réaction sur la plaque MAP16.
Générez 20 000 microréactions dPCR à chaque fois
Pour mettre en évidence la constance exceptionnelle du remplissage des micro-chambres, nous avons effectué une étude pour démontrer la répétabilité des nombres de micro-chambres très acceptées sur la MAP pour différents dosages (Figure 3). Pour cette étude, nous avons analysé 14 plaques à l’aide de dosages CQ standard internes. Dans le flux de travaux dPCR, une fois la dPCR terminée, le logiciel d’analyse QuantStudio Absolute Q trouve et inspecte chaque micro-chambre dans un réseau ou une réaction dPCR à l’aide d’un canal CQ, puis n’accepte que les micro-chambres présentant un remplissage uniforme et aucun signe évident de débris d’auto-fluorescence non liée à la PCR. Sur les 14 plaques incluses dans l’étude, nous avons identifié une acceptation moyenne des micro-chambres de 99,7 % (±0,6 %). Nous avons tracé le nombre total de micro-chambres acceptées par réseau sur chacune des 14 MAP pour montrer la constance globale sur chacune des plaques. La ligne en pointillés à 20 480 indique le nombre total de micro-chambres disponibles sur la MAP. Dans tous les réseaux, nous avons noté une moyenne de 20 417 micro-chambres (±133) acceptées par plaque.
Cliquez sur l’image pour l’agrandir Figure 3.
Pourquoi le nombre de micro-chambres analysées est-il important ?
Parce que les statistiques sont à la base de l’analyse dPCR.
À l’aide de la modélisation de Poisson (ci-dessus), le nombre total de micro-chambres analysées et le volume de micro-chambre sont utilisés pour calculer les concentrations finales à partir des réactions dPCR. Il est donc essentiel que ces deux variables soient très constantes et calculées avec précision. La technologie MAP améliore la constance du nombre total de micro-chambres acceptables, la précision de volume globale et, par conséquent, la quantification globale.
Ressources supplémentaires
Références
- Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988;239(4839):487-491.
- Huggett JF, Foy CA, Benes V, et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin Chem. 2013;59(6):892-902.
- Quan PL, Sauzade M, Brouzes E. dPCR: A Technology Review. Sensors (Basel). 2018;18(4):1271.
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
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