简介

实时荧光定量 PCR,又称为定量 PCR 或 qPCR,可以为测定样品中的靶标序列或基因数量提供简单、简洁的方法。该方法高度简化,有时会忽略实现方法方面的关键因素,因此导致出现问题。本文将重点强调设置和评估实时荧光定量 PCR 反应时必须考虑的这些因素。

   

   图1.实时荧光定量 PCR 数据的图形表示。Rn 是报告基团染料的荧光除以惰性参比染料的荧光的比值;即,Rn 是归一化到 Applied Biosystems™ ROX™ 染料的荧光信号的报告基团信号。(A) 在此视图中,Rn 根据 PCR 循环数进行绘制。(B) ΔRn 为 Rn 减去基线;ΔRn 根据 PCR 循环数进行绘制。(C) 扩增图显示对数 (Δrn) 随 PCR 循环数的变化。

   

可能影响 Ct 的因素

Ct(阈值循环)是扩增曲线与阈值线的交叉点(图 1B)。它是 PCR 反应中靶标浓度的相对测量。除靶标浓度之外,还有很多因素会影响 Ct 的绝对值。我们将要讨论最常见的可能影响 Ct 值的非模板依赖性因素,并描述如何评估实时荧光定量 PCR 反应的性能。

上述图 1 显示实时反应扩增图的几个参数。图 1B 中的指数期对应于图 1C 中的线性期。在图 1C 中,阈值必须设在扩增图的线性期中。Ct 值随模板量减少而增加。然而,反应混合物或仪器中的任何干扰,只要能影响与 Ct 计算相关的荧光测定,都会使 Ct 值产生非模板依赖性的变化。因此,在不同条件下或用不同试剂进行的 PCR 反应产生的 Ct 值不可以直接进行比较。 

图 2.  在使用具有相同 ROX 水平的两种预混液的一次检测中获得的原始荧光数据。信号差异是由预混液的成分造成的。使用 Applied Biosystems™ VIC™/MGB 探针在 Applied Biosystems™ 7900HT 快速实时荧光定量 PCR 系统上执行此反应。x 轴显示荧光基团的的发射波长,y 轴显示发射强度。

预混液成分的影响

任何分子的荧光发射都受环境因素的影响,比如溶液的 pH 值和盐浓度。图 2 显示某个 Applied Biosystems™ TaqMan® 探针在两种不同预混液背景下的原始荧光数据。请注意,尽管两组反应的靶标、探针和 ROX 染料浓度都相同,预混液 A 中的荧光强度更高。

因此,如图 3 所示,产生的 ΔRn 值也不同。请注意,荧光信号基线属于非模板依赖性因素,两种预混液的基线是不同的(图 3A)。Ct 值的变化并没有反映出反应系统的整体性能(图 3B)。灵敏度相当的预混液产生的 Ct 绝对值可能不同。

图 3.使用预混液 A 和预混液 B 在等量的人类 gDNA 中进行 RNase P 扩增。(A) Rn 根据循环数进行绘制,并且显示两个反应的基线。(B) 对数 (ΔRn) 根据循环数进行绘制。两种预混液的阈值(绿线)设定为相同水平。对于相同浓度的靶标而言,预混液 B 的 Ct 值 (CtB) 早于预混液 A 的相应值 (CtA),表明预混液 B 的基线较低。使用 Applied Biosystems™ 7500 实时荧光定量 PCR 系统执行所有扩增。

ROX 惰性参比染料

Rn 值是由 Applied Biosystems™ FAM™ 染料的荧光除以 ROX 染料的荧光而计算得出的比率。因此,假定 FAM 染料产生的荧光信号保持不变,ROX 染料量越少,产生的 Rn 值就越高。这将导致 Rn 基线上升,以及随后 ΔRn 的减少和 Ct 值的变化。通过降低 ROX 染料水平而得到不同 Ct 值,没有对反应的真实灵敏度产生任何影响,却有着意想不到的后果。如图 4 所示,降低 ROX 染料的浓度可能会增加 Ct 值的标准差。标准差越大,分辨靶浓度之间的细微区别的可信度就越低(参加下文的精确度一节)。

图 4.  使用包含 3 种不同浓度的 ROX 染料的预混液对 TGF-β 进行扩增。显示 (A) Ct 值和 (B) 标准差随 ROX 染料浓度的变化。降低 ROX 染料浓度导致 Ct 出现得更早,但是会增大标准差。使用 Applied Biosystems 7500 实时荧光定量 PCR 系统执行所有扩增。

PCR 反应的效率

PCR 反应的效率也会影响 Ct 值。在低效率条件下进行连续稀释扩增,与高效率条件下相比,可能会产生斜率不同的标准曲线。在图 5 中,两个样品(X 和 Y)分别在低效率和高效率条件下扩增,在靶浓度相同的条件下得到了不同的 Ct 值。在此示例中,尽管高效率条件(图 5 中的蓝色曲线)在高浓度时产生的 Ct 值更晚,但它在靶浓度低时却更为灵敏。PCR 效率取决于实验、预混液性能和样品质量。通常情况下,反应效率在 90-110% 之间都是可以接受的。另一方面,假定所有其他因素如仪器、试剂和实验完全相同, 该效率也有助于得出第一个样品的模板量更少的结论。然而,如果产生两个 Ct值使用的是不同的仪器、试剂、引物和探针或反应体积,该结论就不成立。因此,只有在使用上文定义的相同反应条件来比较实验时,Ct 绝对值的比较才有意义。

图 5.Ct 随 PCR 效率发生变化。蓝色标准曲线的效率为 100%(斜率为 –3.3)。绿色标准曲线的效率为 78%(斜率为 –4)。与高效率条件相比(蓝色),在低效率条件下(绿色),扩增量 Y 使 Ct 出现得更早。较低扩增量 (X) 时则情况相反,与高效率条件(蓝色)相比,低效率条件(绿色)使 Ct 出现得更晚。

如何评估实时荧光定量 PCR 反应的性能

为了比较不同条件(例如两种不同的预混液或两台不同的仪器)下的两个反应,必须评估以下参数。

动态范围

为了正确地评估 PCR 效率,至少需要 3 次重复和至少 5 个数量级倍数的模板浓度。图 6 说了建议此精确级别的理由,它证明在 1 个数量级倍数与 5 个数量级倍数范围内测试稀释模板时,获得的斜率或效率可能产生数学偏差。因此,即使检测 100% 有效,由于每个稀释点都存在标准差,检测一个数量级倍数的连续稀释时,可能获得 70 至 170% 的范围。在 5 个数量级倍数范围内做相同数量的稀释点或重复,可能的偏移只有 ±8%。这意味着在 5 个数量级倍数范围内,如果效率为 94%,则该实验的效率范围介于 88% 到 100% 之间。为了准确测定 PCR 反应的效率,必须进行 5 个数量级倍数的连续稀释。-3.3 ±10% 的斜率意味着效率达到 100% ±±10%。PCR 反应效率越低,那么灵敏度越低。

R2

另一个评估 PCR 效率的关键参数是 R2,它是说明如何使用一个数值预测另一个数值的相关程度的统计学术语。如果 R2 为 1,那么 Y 值 (Ct) 可以用来准确预测 X 值(图7A)。如果 R2 为 0,那么就不能通过 Y 值预测 X 值(图 7B)。R2 值 >0.99 表示两个数值之间相关的置信度良好。

精确度

标准差(偏差的平方根)是最常用的精确度计量方法。如果许多数据点都靠近平均值,则标准差就小;如果许多数据点都远离平均值,则标准差就大。

实际上,足够多重复次数产生的数据集会形成大致的正态分布。这经常可通过经典的中心极限定理来证明,该定理称大量独立同分布随机变量的和在无限多时趋向于正态分布。如图 8A 所示,约 68% 的值在平均值的 1 个标准差之内,约 95% 的值在平均值的 2 个标准差之内,约 99.7% 的值在平均值的 3 个标准差之内。

如果 PCR 效率为 100%,那么 2 倍稀释时两个连续浓度之间的 Ct 差为1(图 8B)。要在 99.7% 以上的情况下定量 2 倍稀释,标准差必须 ≤0.167。标准差越大,分辨 2 倍稀释的能力就越低。要在 95% 以上的情况下区别 2 倍稀释,标准差必须 ≤0.250(图 8C)。

灵敏度

无论 Ct 绝对值是多少,任何能够有效扩增和检测起始模板拷贝数为 1 的系统都达到了灵敏度的极限。

如前文所述,效率是决定反应灵敏度的关键因素(图 5)。在检测极低拷贝数时的另一个重要的考虑因素是,不能预期模板为正态分布。相反,它会遵循泊松分布,该分布预测在平均包含一个拷贝的起始模板的大量重复中,实际上约 37% 不含拷贝,仅有约 37% 含有 1 个拷贝,18% 应包含 2 个拷贝(见图 9)。因此,为了可靠地检测低拷贝,必须做大量的重复实验来提供统计显著性,以克服泊松分布的限制。

图 6.  准确计算 PCR 效率取决于连续稀释所用模板量的范围。对于具有 5 个稀释点的 2 倍稀释(橙色)而言,其可能的偏移高于具有 5 个稀释点的 10 倍稀释(蓝色)。

 

图 7.为 2 条直线计算出 R2 值的示例。(A) x 和 y 值直接相关。(B) x 和 y 值无关。

图 8.正态分布和标准差。(A) 已显示数据的正态分布。PCR 效率为 100% 时,2 倍连续稀释中的两个连续样品的平均值之间的 Ct 之差为1(样品 X 和样品 Y)。(B) 为了能够在 99.7% 的情况下为两个样品定量,标准差必须低于 1 个 Ct 除以 6 个标准差的值 (1/6 = 0.167)。(C) 为了能够在 95% 的情况下为两个样品定量,标准差必须低于 1 个 Ct 除以 4 个标准差的值 (1/4 = 0.25) 。

图 9.低拷贝数的泊松分布。蓝色曲线代表 3.3 pg DNA(1 个 DNA 拷贝)的泊松分布。粉色曲线代表 6.6 pg DNA(1 个细胞,2 个 DNA 拷贝)的泊松分布。

表1.实时荧光定量 PCR 的性能评估。

因素 建议 标准
效率 5 个数量级倍数的连续稀释 斜率:~ –3.3R2 >0.99
精确度 最少 3 次重复 标准差 <0.167
灵敏度 泊松分布导致低拷贝数样品输入需要重复多次反应 统计检验分析

结论

比较不同的反应条件时,使用效率、R2、精确度和灵敏度来确定 PCR 反应的性能。为了精确严谨地评估,表 1 中所列的所有因素都必须评估。除了这些因素,还必须评估和验证合适的实验对照(比如无模板对照、无 RT 对照)及模板质量。