简介

实时荧光定量 PCR、传统 PCR 与数字 PCR 概述

数字 PCR 实时荧光定量 PCR 传统 PCR
概述 测量阴性平行样的比例以确定绝对拷贝数。 在发生 PCR 扩增时进行测量。 在 PCR 循环结束时测量积聚的 PCR 产物的量。
定量? 是,阴性 RCR 反应的比例适合泊松统计算法。 是,因为在 PCR 的指数(对数)期内采集数据,在此期间 PCR 产物的数量与核酸模板的量成正比。 否,但是比较凝胶上的扩增条带的强度与已知浓度的标准品可为您提供“半定量”结果。
应用
  • 病毒载荷绝对定量
  • 核酸标准品绝对定量
  • 下一代测序文库绝对定量
  • 稀有等位基因检测
  • 基因表达绝对定量
  • 混合物富集和分离
  • 基因表达定量
  • 芯片验证
  • 质量控制和检测验证
  • 病原体检测
  • SNP 基因分型
  • 拷贝数变异
  • microRNA 分析
  • 病毒定量
  • siRNA/RNAi 实验

DNA 扩增用于:

  • 测序
  • 基因分型
  • 分子克隆
总结

数字 PCR 的优点:

  • 无需依赖参考物或标准品
  • 通过增加 PCR 平行样的总数可实现所需的精度
  • 高度耐受抑制剂
  • 能够分析复杂混合物
  • 与传统 qPCR 不同,数字 PCR 对出现的拷贝数呈线性反应,可以检测到较小倍数变化的差异。

实时荧光定量 PCR 的优点:

  • 提高检测的动态范围
  • 无需 PCR 后处理
  • 检测能够覆盖低至 2 倍的变化
  • 在 PCR 的指数期内采集数据
  • 报告基团荧光信号的增加与生成的扩增子数量成正比
  • 裂解探针提供扩增子的永久裂解记录

传统 PCR 的缺点:

  • 精确度差
  • 灵敏度低
  • 动态范围小 < 2 logs
  • 分辨率低
  • 非自动化
  • 仅限基于规格的区别分析
  • 结果未表示为数字
  • 使用溴化乙锭染色不足以定量
  • PCR 后处理

 要了解为什么传统 PCR 存在限制,务必要了解 PCR 反应过程中发生了什么。基本 PCR 运行可以分为三个阶段:

指数期

每个循环积聚的产物准确加倍(假定 100% 反应效率)。该反应具有高度特异性和精确度。出现指数式扩增,因为所有试剂均新鲜可用,反应的动力学推动反应有利于扩增子加倍。

线性期(高变异性)

随着反应继续,一些试剂因扩增而被消耗。反应开始减缓,并且每个循环的 PCR 产物不再加倍。

平台期(终点:使用传统方法进行凝胶检测)

反应停止,不再产生更多产物,并且如果放置时间够长,PCR 产物将开始降解。因为每个样品具有不同的反应动力学,所以每支试管或每个反应将在不同的时间点进入平台期。在平台期可以看到这些差异。在平台期内,传统 PCR 进行测量,又称为终点检测。

 图 1:PCR 各阶段。

传统 PCR 在平台期测量时结果存在变异

在图 2 中,三个复制样品在反应开始时具有相同量的 DNA,在反应的平台期具有不同量的 PCR 产物(反应动力学变化所致)。因此,在指数期内进行测量将更加精确,在该阶段复制样品呈指数式扩增。

图 2:到 PCR 的平台期,相同样品将产生不同量的反应产物。

实时荧光定量 PCR 在指数期测量可实现更加准确的定量

实时荧光定量 PCR 集中于指数期,因为它可提供更加精确的数据进行定量。在指数期内,实时荧光定量 PCR 仪器计算两个数值。阈值线是反应的荧光强度超过背景时的检测水平。样品达到此水平的 PCR 循环称为循环阈值 (Ct)。Ct 值用于下游定量或存在/缺失检测。通过比较未知浓度的样品与一系列标准品的 Ct 值,可以精确测定未知反应中的模板 DNA 数量。

图3:样品荧光强度超过背景的 PCR 循环称为循环阈值或 Ct。

数字 PCR 统计个别分子可实现绝对定量

数字 PCR 的工作原理在于将样品分割到许多单独的实时荧光定量 PCR 反应中;这些反应部分包含了目标分子(阳性),而其他不包含(阴性)。PCR 分析后,一部分阴性结果用于生成样品中目标分子精确数量的绝对结果,而无需参考标准品或内源性对照品。

图4:  数字 PCR 使用阳性(黑色)与阴性(白色)PCR 反应的比例来计算目标分子的数量。

基于 Applied Biosystems TaqMan 探针和 SYBR Green 的检测

每个实时荧光定量 PCR 反应包括一个荧光报告基团分子——Applied Biosystems™ TaqMan® 探针或 SYBR™ Green 染料,例如用于监测 PCR 产物积聚。随着靶标扩增子数量增加,荧光基团发出的荧光量也随之增加。

图5:  实时荧光定量 PCR 与传统 PCR 的优点

Applied Biosystems 提供全系列的实时荧光定量 PCR 产品,满足常规和具有挑战性的应用需求。

Applied Biosystems 提供齐全的产品用于基于实时荧光定量 PCR 的基因表达、miRNA、拷贝数变异和 SNP 基因分型分析,涵盖从现成的基因特异性探针和引物组,到日常使用的试剂和塑料器具、仪器系统、软件和这两者之间的所有产品。