我们已开发出两种类型的试剂,使用实时荧光定量 PCR (qPCR) 仪器可检测 PCR 产物:

哪种实时化学试剂最适合您?

  基于 SYBR Green 的检测   基于 TaqMan 的检测
 
 
使用 Applied Biosystems™ SYBR™ Green 染料(dsDNA 结合染料)来检测 PCR 过程中积聚的 PCR 产物。
 
 
使用目的基因特异性的 荧光探针来检测 PCR 过程中积聚的靶点。
特异性 中*  
灵敏度低的拷贝数 可变的*   1-10 拷贝数
可重复 中*  
多重性     是
预设计实验     是
通常需要用户设计、实验优化 是    
基因表达 低等水平定量   高等水平定量
应用 基因表达
DNA 定量(病原体检测)
CHiP
  基因表达
DNA 定量
CHiP
SNP 基因分型
拷贝数变异
通路分析
microRNA 和小 RNA
突变检测
蛋白质分析
多重
  SYBR Green 引物

SYBR Green 预混液

  TaqMan 检测试剂盒

TaqMan 预混液

* 取决于模板质量和引物/设计优化。

图像

图 1:基于 TaqMan 和基于 SYBR Green 的检测工作流程比较。

TaqMan 方法

背景

最初,使用嵌入式染料进行实时荧光PCR产物定量。但这些染料存在重大缺点,即会同时检测特异性以及非特异性 PCR 产物的扩增量。

TaqMan 方法的开发

通过引入基于Taq DNA 聚合酶 5’ 核酸酶活性的荧光标记探针,实时定量 PCR 系统得到了显著提升。这些荧光探针的使用,使得实时定量的方法得到了发展,实现了仅对特定扩增产物的检测。

逐步过程

 

  1. 构建一段寡核苷酸探针:5’ 端标记报告基团荧光染料,3’ 端标记淬灭基团染料。当探针完整时,邻位的淬灭基团可以通过荧光共振能量转移 (FRET) 大幅降低报告基团染料发出的荧光。
  2. 如果存在目标序列,探针便会在其中一个引物结合位点的下游发生退火,并随着引物的延伸通过 Taq DNA 聚合酶的 5’ 核酸酶活性,完成切除。
  3. 探针的切除将会引起:
    -- 将报告基团染料和淬灭基团染料进行分离,增强了报告基团染料的信号。
    -- 将探针从目的链上去除,使引物继续沿模板链末端延伸。因此,探针的介入并不会抑制整个PCR过程。
  4. 每经过一个循环,就会有更多的报告基因染料分子从各自的探针上切断,荧光强度会随着合成的扩增片段数量的增加而增加。
 


图像

图 2:基于 TaqMan 探针的检测试剂的概述。

两种类型的 TaqMan 探针

我们可提供两种类型的 Applied Biosystems™ TaqMan® 探针:

  • TaqMan 探针(含有 TAMRA™ 染料——淬灭基团染料)
  • TaqMan® MGB 探针

推荐用于等位基因检测的 TaqMan MGB 探针

我们一般推荐使用 TaqMan MGB 探针进行等位基因分型分析,特别是当传统 TaqMan 探针超过30个核苷酸时。TaqMan MGB 探针包含:

  • 位于 3’ 端的非荧光淬灭基团——由于淬灭基团不发出荧光,因此实时荧光定量 PCR 仪器可以更精确地检测出报告基团染料
  • 位于 3’ 端的小沟结合物——小沟结合物可提高探针的熔解温度 (Tm),缩短探针的长度。

最终,TaqMan MGB 探针会在匹配和未匹配探针之间展现出更大的 Tm 值差异,从而提供更准确的等位基因分型。

TaqMan 方法的优点

  • 需要在探针和目标分子(靶点)之间发生特异性的水解(杂交),方可生成荧光信号
  • 您可使用明显不同的报告基因染料标记探针,在一个反应管内扩增并检测两个不同的序列
  • 无需 PCR 后处理,减少分析工作量并节省材料成本

TaqMan 方法的缺点

主要缺点在于需要根据不同的序列,合成不同的探针。

SYBR 试剂或其他双链 DNA 结合染料

背景

一般将可与双链DNA发生结合的小分子分为以下两类:

  • 嵌入剂
  • 小沟结合物

无论哪种结合方法,用于PCR实时检测的DNA结合染料都需要满足以下两个条件:

  • 结合至双链DNA时,会有增强的荧光
  • 对 PCR 不会产生抑制

我们开发更加优化的条件,使得 SYBR Green I 染料的使用对 PCR 产生轻微抑制并带来相对于溴化乙锭更为灵敏的检测。另外,我们还有更新的 SYBR Green 染料,可发出更亮的荧光,并且与初代 SYBR Green I 相比,对 PCR 的抑制更少。

SYBR 染料试剂工作原理

SYBR 染料通过与 PCR 过程中形成的双链 DNA 结合来检测聚合物链反应 (PCR) 产物。工作原理:

逐步过程

  1. 当 SYBR 染料加入到样品中后,它可立即与样品中的所有双链 DNA 进行结合 。
  2. 在 PCR 过程中,DNA 聚合酶对产生 PCR 产物的目标序列进行扩增。
  3. 随后,SYBR 染料会与每一个新产生的双链 DNA 分子进行结合。
  4. 随着 PCR 进行,生成更多 PCR 产物。SYBR® 染料可与所有的双链 DNA 结合,因此荧光强度也会随着 PCR 产物的增加而增加。

SYBR 染料的优点

  • 它可用于监测任何双链 DNA 序列的扩增。
  • 无需探针,可降低检测设置和运行成本,假定您的 PCR 引物经过精心设计并且反应的表征良好。

SYBR 染料的缺点

最大缺点在于可能会产生假阳性信号;即,因为 SYBR 染料可与任何的双链 DNA 发生结合,因此也会与非特异性的双链 DNA 序列发生结合。因此,使用经过精心设计的引物极其重要,这样不会扩增非目标序列,并执行熔解曲线分析。

其他注意事项

采用 DNA 结合染料的另一原因,是多种染料分子可能与单一扩增 DNA 分子结合。基于多重染料的结合,将迎来信号量取决于在反应中所产生的双链DNA量的局面。因此,如果扩增效率相同,相较于对较短产物的扩增,对较长产物的扩增将会产生更多的信号。这完全不同于荧光探针,使用荧光探针时,对于每个合成的扩增分子淬灭仅释放一个荧光基团,与其长短并不相关。