SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒可提高cDNA产量,提升定量RT-PCR分析的动态范围。 这意味着无论您的目的基因丰度如何,您都能获得相对应的cDNA相对含量。

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极佳的线性度

希望 RT 反应能得到一致的结果吗? 希望在最宽泛的起始样本量范围下都得到前所未有的线性关系吗? 采用SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒,您就可以获得:

  • 对于基于探针的两步法定量RT-PCR,可在20 µl反应中,使用1 pg到2.5 µg总RNA获得线性cDNA产量
  • 对于SYBR® GreenER™两步法定量RT-PCR,可在20 µl反应中,使用1 pg到100 µg总RNA获得线性cDNA产量

如果需要更多cDNA,并维持相同的反应线性度,则可以将反应体积扩大至100 µl。

在 RT 步骤中得到优异的线性关系意味着:

  • 无论基因丰度如何,产生的cDNA qPCR模板都具有相同的相对表示结果
  • 在标准化过程中,即便起始材料的丰度有差异,亦可获得目的基因和参照基因cDNA合成的线性结果
  • 降低这种常见的偏差,提高qRT-PCR数据的准确度

在宽广的起始RNA线性范围内获得可靠的性能

图1. SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒在宽广的起始RNA线性范围内都具有可靠的性能。 在ABI PRISM® 7900HT实时荧光定量PCR系统中,采用SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒对连续稀释的HeLa细胞总RNA进行逆转录,随后采用人β-actin TaqMan®分析试剂盒 (Applied Biosystems) 和通用型EXPRESS qPCR SuperMix (Invitrogen) 进行三重qPCR反应。 标准曲线 (A) 表明,即使超出了建议的 1 pg 至 2.5 μg 的最适起始用量范围,该试剂盒可在采用高达 5 μg 的 RNA 样品进行实验时其相关系数达到 0.996。 扩增曲线 (B) 显示,在各种稀释条件下,三次重复的结果均可排列在近似的曲线上,表明了SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒在宽广的起始RNA线性范围内均具有稳定的性能。 用参比基因来标化低丰度基因,无需担心不同的 RNA 起始用量可能导致的反转录效率的偏差。

产量提高且qPCR抑制减小

SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒可以生成更高产量的cDNA,且对下游qPCR的抑制减小。 这意味着您能:

  • 保存cDNA以备将来研究之用
  • 在qPCR中使用更多的cDNA,提高灵敏度达4倍,且不必担心反应受到抑制

此优势是通过很好地平衡了 SuperScript® III RT、RNaseOUT™ RNase 抑制剂、和加入的专有辅助蛋白而获得的。当靶标为低拷贝时,qRT-PCR 试剂具有的优势则更为明显。

  图2. SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒可减少对于实时荧光定量PCR应用中PCR反应的抑制,从而提高了分析灵敏度。 通过32P-dCTP掺入实验分析cDNA产量。 使用相同用量的起始 HeLa RNA,比较三种不同试剂盒的 cDNA 产量: 用于qRT-PCR的Invitrogen SuperScript® III第一链合成SuperMix、SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒和MMLV。 VILO™试剂盒的cDNA合成产量比另一种Invitrogen试剂盒高3至4倍,比MMLV高8至9倍。

  图3. SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒的产量较同类产品更高。 在ABI PRISM® 7900HT实时荧光定量PCR系统中,采用SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒 (蓝色) 或Mulv同类试剂盒 (绿色) 对HeLa细胞总RNA (2 μg和1 ng) 进行逆转录,随后采用人β-actin TaqMan®分析 (Applied Biosystems) 和通用型EXPRESS qPCR SuperMix (Invitrogen) 进行三重qPCR反应。 无论是起始RNA量较多还是较少时,SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒的性能均优于Mulv同类试剂盒至少2个循环,表示其灵敏度增加4倍。

检测的灵活性

无论用什么检测方法,都能使用SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒获得最灵敏的qPCR性能。 使用任意一种基于SYBR®的实时荧光定量PCR检测方法,相比于其他可用试剂盒,有望将灵敏度增加多达8倍。 SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒既可作为单独的产品,也可作为新型EXPRESS系列qPCR和qRT-PCR试剂的一个组分,在快速实时荧光定量PCR仪器上使用。

图4. SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒可与SYBR® Green或基于荧光探针/引物的qPCR检测试剂配合使用。 A. 采用Invitrogen的SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒 (蓝色)、Bio-Rad的iScript™ cDNA合成试剂盒 (黄色)、Qiagen的QuantiTect®逆转录试剂盒 (绿色) 和Stratagene的AffinityScript® QPCR cDNA合成试剂盒 (粉色) 对等量的HeLa细胞总RNA (10 pg) 进行逆转录。 随后采用Invitrogen SYBR® GreenER™ qPCR SuperMix和hsp70基因特异性引物,在ABI PRISM® 7900HT实时荧光定量PCR系统上对生成的cDNA进行三重扩增。 SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒与SYBR® Green检测同时使用时,灵敏度高于其他试剂盒,表现为至少可以提前2个循环达到Ct值。 B. 采用与A中相同的试剂盒对等量的HeLa细胞总RNA (1 μg) 进行逆转录。随后采用EXPRESS qPCR SuperMix和预混合的ROX及TfR基因特异性TaqMan®分析 (Applied Biosystems),在ABI PRISM® 7900HT实时荧光定量PCR系统上对获得的cDNA进行三重扩增。 SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒与基于探针的检测同时使用时,灵敏度高于其他试剂盒,表现为至少可以提前2个循环达到Ct值。