免疫沉淀产品及解决方案

免疫沉淀产品及解决方案(IP)

论文趋势显示使用磁珠法是成长最快的免疫沉淀方法Invitrogen™ Dynabeads™产品是使用最广和引用最多的产品。为何会出现这种现象?因为 Dynabeads 磁珠可小规模分离特殊蛋白(如免疫沉淀蛋白复合物免疫共沉淀,co-IP)提供结合能力/得率、重复 性、纯度和成本的最佳平衡。

蛋白劲促低至3折

自20世纪70年代出现琼脂糖“Sepharose 混合物”以来,纯化大量蛋白质或抗体成为焦点问题,人们对蛋白质纯化和研究的需求发生了巨大改变。如果这是您的主要应用,那么琼脂糖/树脂纯化柱依然可以解决问题。


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本页内容:

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免疫沉淀磁珠的优势

与使用传统琼脂糖或其他琼脂糖树脂进行目标蛋白pull-down相比,磁珠是一种更快、更简单和更有效的方法,已成为免疫沉淀和pull-down分析的金标准。Dynabeads磁珠可帮助您实现高产量、高重现性与低非特异性结合、低成本之间的最佳平衡。请观看这些免疫沉淀误区视频,帮助您更直观地理解Dynabeads磁珠的优势。

Dynabeads技术的优势总结:

  • 低背景——几乎没有非特异性结合,无需预纯化即可获得高纯度蛋白质产量。
  • 高重现性——均一磁珠可确保最一致的结果。
  • 高灵敏性——大部分引用方法是用于低丰度蛋白的敏感型应用,如ChIP和IP。
  • 快速简单——可在40分钟内完成,无需离心和预纯化步骤。
  • 节省抗体——所有结合均发生于磁珠光滑的外表面,可节约珍贵抗体并支持经济有效的解决方案。
  • 灵活——产品覆盖IP、Co-IP、pull-down和ChIP分析;适用于手动和自动化方案。
  • 可实现免疫沉淀自动化——了解现在的Thermo Scientific KingFisher 平台如何支持免疫沉淀自动化。
工作原理(磁珠式免疫沉淀)

使用Dynabeads磁珠作为蛋白质分离的固相载体,可轻松快速完成免疫沉淀,全程只需4个简单步骤:

  1. 抗体与磁珠结合。Dynabeads磁珠预先包被protein A、protein G、抗鼠IgG或抗兔IgG抗体,基于快速动力学,加入的抗体仅需10分钟即可结合到磁珠上。生物素化抗体也可用于与链霉亲和素偶联的Dynabeads结合。在磁力架上清洗磁珠一次,除去未结合的抗体。
  2. 将样品加到磁珠中。将蛋白质样品加到清洗后的抗体结合磁珠中,孵育10分钟,使目标蛋白结合。如果蛋白质是低丰度或低亲和力的,可延长孵育时间至1小时或过夜孵育;但是,孵育10分钟通常已足够。
  3. 清洗蛋白质结合的磁珠。为确保结合的目标蛋白具有高纯度,应在磁力架上用缓冲液清洗磁珠2-4次,去除所有未结合蛋白。有效的分离过程可确保获得高信噪比。
  4. 洗脱蛋白质。根据需要,使用中度洗脱方案或变性洗脱方案将蛋白质从磁珠上洗脱下来详情请参见以下洗脱说明)。

该方案简单、快速,无需预纯化步骤,可获得较高的目标蛋白纯度、产量和一致性结果。
 

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蛋白质洗脱特点

蛋白质洗脱特点

磁珠上的重组protein A和/或protein G不含白蛋白结合位点,可避免污染蛋白的共纯化。抗体与磁珠在溶液中的结合,是一个平衡反应。为获得最多的抗体,应采用较低的反应体积,以维持磁珠和抗体的高浓度。由于无需对样品进行预处理(即使是粘稠样品),因此,无需稀释样品或磁珠。如果怀疑样品中的抗体浓度非常低,可增加磁珠的使用量。

为替代从磁珠上将抗体洗脱下来,Dynabeads可在磷酸钠盐缓冲液中重悬。防止发生共洗脱,可在免疫沉淀前将抗体和protein A/G交联。这一步对于下游SDS-PAGE及放射自显影或免疫印迹分析是不必要的,对于银染或考马斯染料染色是可选的。

为您的实验寻找正确的免疫沉淀产品

对比所有3种分离策略

如果您具有可识别目标蛋白的抗体,请选择该产品

如果您的下游检测为质谱分析,或者如果您不希望抗体与目标蛋白共洗脱,可选择抗体结合产品。

抗体结合是最常用的方法,适用于目标抗体能与磁珠直接结合或者能与磁珠表面的预包被配体间接结合的情况。

抗体结合产品选择指南

  Protein A、G和A/G 二抗
(抗鼠、抗兔)
表面活化磁珠(环氧树脂)*
结合性质 非共价抗体结合 非共价抗体结合 共价抗体结合
抗体从磁珠上共洗脱
配体类型 不同的配体可与不同的物种的抗体亚类以不同特异性结合 鼠抗可结合鼠IgG1、IgG2a和IgG2b;兔抗可结合所有IgG 所有抗体
质谱兼容性 兼容(Protein A/G);尚未验证(Protein A、G)
非特异性结合 超低
抗体结合时间和温度(RT=室温)
  • Protein A:10 min, RT
  • Protein G:10–40 min, RT
  • Protein A/G:60 min, RT
>30 min, 2–8°C 16–24 hr, 37°C
产品

仅磁珠:

试剂盒:

仅磁珠:

试剂盒:

* 查看用于结合和捕获其他靶标的Dynabeads更多表面活化Dynabeads
† 交联可避免抗体的共洗脱,但会降低目标蛋白的产量。
‡ 了解何种抗体结合蛋白是您的免疫沉淀抗体的最佳选择。

如果您具有可识别目标蛋白的生物素抗体(或配体),请选择该产品。

使用生物素结合抗体和链霉亲和素包被磁珠进行免疫沉淀具有以下优势:

  • 如果您的样品富含可溶性IgG
  • 如果您的重组抗体缺少Fc区域
  • 如果您的实验室已具备链霉亲和素包被的Dynabeads
  • 如果您需要可兼容质谱分析的磁珠(二级包被和环氧树脂包被的Dynabeads也能兼容质谱分析)

为提高灵活性,我们可提供4种不同的链霉亲和素偶联的Dynabeads。请在Dynabeads链霉亲和素选择指南中查看不同特性。

在过去的25年中,链霉亲和素偶联的Dynabeads与生物素结合配体结合,已被广泛用于多种手动和自动化应用,并被成千上万篇文章引用。该技术在纯化核酸(NA)中的应用最多,但也会被用于免疫沉淀(IP)。

如果您具有重组(融合标签)蛋白,请选择该产品

用于重组蛋白表达的热门融合标签包括:

  • His标签——由6至9个组氨酸残基串联组成;主要用于固定化金属离子亲和层析(IMAC)纯化。
  • GST标签——由谷胱甘肽S转移酶(GST)组成,共211个氨基酸蛋白(26 kDa);主要用于谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化。
  • HA标签——由来自人流感血凝素(HA)蛋白的多肽(YPYDVPDYA)组成;固定化抗HA抗体可用于对HA标记的重组蛋白进行免疫沉淀。
  • c-Myc标签——由来自人c-myc癌基因(p62 c-myc)的多肽(EQKLISEEDL)组成;固定化抗c-Myc抗体可用于对c-Myc标记的重组蛋白进行免疫沉淀。

His和GST不是真正的表位标记,因为它们通常不是利用特异性抗体进行纯化或检测的。相反,HA和c-Myc标签是真正的表位标记,因为它们只能通过特异性抗体进行纯化或检测。表位标记几乎不被用于大量纯化,但经常被用于免疫沉淀或免疫共沉淀(IP,co-IP)。然而,这4种标签系统均可用于纯化或pull-down应用。

如果您已具有可识别目标蛋白的生物素化抗体,您可使用以上任意一款产品创建您自己的亲和产品。

如果您具有可识别目标蛋白的抗体,请选择该产品

如果您的下游检测为质谱分析,或者如果您不希望抗体与目标蛋白共洗脱,可选择抗体结合产品。

抗体结合是最常用的方法,适用于目标抗体能与磁珠直接结合或者能与磁珠表面的预包被配体间接结合的情况。

抗体结合产品选择指南

  Protein A、G和A/G 二抗
(抗鼠、抗兔)
表面活化磁珠(环氧树脂)*
结合性质 非共价抗体结合 非共价抗体结合 共价抗体结合
抗体从磁珠上共洗脱
配体类型 不同的配体可与不同的物种的抗体亚类以不同特异性结合 鼠抗可结合鼠IgG1、IgG2a和IgG2b;兔抗可结合所有IgG 所有抗体
质谱兼容性 兼容(Protein A/G);尚未验证(Protein A、G)
非特异性结合 超低
抗体结合时间和温度(RT=室温)
  • Protein A:10 min, RT
  • Protein G:10–40 min, RT
  • Protein A/G:60 min, RT
>30 min, 2–8°C 16–24 hr, 37°C
产品

仅磁珠:

试剂盒:

仅磁珠:

试剂盒:

* 查看用于结合和捕获其他靶标的Dynabeads更多表面活化Dynabeads
† 交联可避免抗体的共洗脱,但会降低目标蛋白的产量。
‡ 了解何种抗体结合蛋白是您的免疫沉淀抗体的最佳选择。

如果您具有可识别目标蛋白的生物素抗体(或配体),请选择该产品。

使用生物素结合抗体和链霉亲和素包被磁珠进行免疫沉淀具有以下优势:

  • 如果您的样品富含可溶性IgG
  • 如果您的重组抗体缺少Fc区域
  • 如果您的实验室已具备链霉亲和素包被的Dynabeads
  • 如果您需要可兼容质谱分析的磁珠(二级包被和环氧树脂包被的Dynabeads也能兼容质谱分析)

为提高灵活性,我们可提供4种不同的链霉亲和素偶联的Dynabeads。请在Dynabeads链霉亲和素选择指南中查看不同特性。

在过去的25年中,链霉亲和素偶联的Dynabeads与生物素结合配体结合,已被广泛用于多种手动和自动化应用,并被成千上万篇文章引用。该技术在纯化核酸(NA)中的应用最多,但也会被用于免疫沉淀(IP)。

如果您具有重组(融合标签)蛋白,请选择该产品

用于重组蛋白表达的热门融合标签包括:

  • His标签——由6至9个组氨酸残基串联组成;主要用于固定化金属离子亲和层析(IMAC)纯化。
  • GST标签——由谷胱甘肽S转移酶(GST)组成,共211个氨基酸蛋白(26 kDa);主要用于谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化。
  • HA标签——由来自人流感血凝素(HA)蛋白的多肽(YPYDVPDYA)组成;固定化抗HA抗体可用于对HA标记的重组蛋白进行免疫沉淀。
  • c-Myc标签——由来自人c-myc癌基因(p62 c-myc)的多肽(EQKLISEEDL)组成;固定化抗c-Myc抗体可用于对c-Myc标记的重组蛋白进行免疫沉淀。

His和GST不是真正的表位标记,因为它们通常不是利用特异性抗体进行纯化或检测的。相反,HA和c-Myc标签是真正的表位标记,因为它们只能通过特异性抗体进行纯化或检测。表位标记几乎不被用于大量纯化,但经常被用于免疫沉淀或免疫共沉淀(IP,co-IP)。然而,这4种标签系统均可用于纯化或pull-down应用。

如果您已具有可识别目标蛋白的生物素化抗体,您可使用以上任意一款产品创建您自己的亲和产品。

(Top)

基准数据:对比Dynabeads与其他免疫沉淀解决方案

本节内容包含了Dynabeads与其他磁性解决方案以及树脂解决方案的结果对比数据。如果您仍在使用Sepharose或琼脂糖微球混合物进行免疫沉淀,您也可能有兴趣观看这些内容丰富的动画,它们将展示关于免疫沉淀的4个误区

对比Dynabeads与树脂解决方案
dynabeads-IP-comparison-fig1

图 1:Dynabeads磁珠具有更短的操作时间和更高的产量。根据说明书,所有免疫沉淀方案采用等量的样品材料(相对于抗体含量)和细胞裂解物体积。在Dynabeads方法中,抗体表面的所有抗体均可有效结合,可实现理想的高重现性抗原结合。

对比Dynabeads与磁性解决方案
dynabeads-IP-comparison-fig2

图2:您选择的磁珠将影响结果。Dynabeads磁珠表面清晰,可完成必要的结合,没有捕获任何多余蛋白的内表面。(A) Dynabeads产品是均一性最好的单分散超顺磁微球,具有高度可控的产品质量和高度可重现性。(B–D) 其他供应商的磁性颗粒形状和大小不一,可捕获杂志,具有较低的重现性和较多的非特异性结合。

dynabeads-IP-comparison-fig3

图3:基准数据表明,Dynabeads磁性产品性能最佳,产量最高且非特异性结合最少。我们的磁珠还去除了不必要的操作步骤,将以最快的方案改善您的实验室生活。

每套入门装均含有 DynaMag-2 磁力架。选择最适合您的入门装相对于单独购买,这种套餐组合可以为节省 21–24%。

套餐类型 货号 内容物 No.  of tests
Magnet with Dynabeads only 10013D Dynabeads Protein A, 2 x 1 mL + DynaMag-2 40
10014D Dynabeads Protein G, 2 x 1 mL + DynaMag-2 40
10015D Dynabeads Protein A, 1 mL
Dynabeads Protein G, 1 mL + DynaMag-2
40
10016D Dynabeads Protein A, 5 mL + DynaMag-2 100
10017D Dynabeads Protein G, 5 mL + DynaMag-2 100
Magnet with Dynabeads IP Kit 10018D Dynabeads Protein A, 2 mL + DynaMag-2
+ Washing and elution buffers
40
10019D Dynabeads Protein G, 2 mL + DynaMag-2
+ Washing and elution buffers
40
视频
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