免疫沉淀(IP)是利用固定在磁珠或琼脂糖树脂等固相支持物上的特异性抗体对抗原进行小型亲和纯化的方法。需要从细胞或组织裂解物中分离用于免疫印迹检测或其他检测技术的蛋白和其他生物分子时,免疫沉淀是最常用的方法之一。

本页内容:

了解以下应用所需的解决方案和产品:


什么是免疫沉淀?采用何种工作原理?

免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)最早作为传统亲和柱色谱的改进方法而开发,包括将样品、洗涤溶液和其他溶液通过固定有靶点特异性抗体的多孔树脂(通常为琼脂糖)柱。我们将少量树脂加入到微量离心管中,并采取间歇式孵育,取代了重力式填充柱的免疫沉淀方法。在每个步骤中,将溶液加到填料中,然后混合并共同孵育(即,填料微球悬浮在溶液中)。在每个孵育步骤的最后,通过离心(或磁性装置;参见下文)使填料沉淀到管底,用移液器移除溶液。

与柱式亲和色谱层析不同,免疫沉淀的目标是仅分离足够用于蛋白免疫印迹分析或其他半定量或定量检测方法的蛋白质。通常,对已处理和未处理的样品进行比较,可评估目标蛋白的相对量。免疫沉淀的基本操作流程如下图所示,其操作步骤可采用两种不同方式完成。

Diagram of immunoprecipitation steps 使用预固定或游离抗体的免疫沉淀(IP)示意图。每个步骤包括孵育、树脂收集(离心或磁性装置)以及溶液移除。每个孵育步骤后都要进行洗涤。最后一步的洗脱通常包括对用于聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)的上样缓冲液中的树脂进行加热,这可导致应被丢弃的蛋白质(包括抗体)发生变性及发生不可修复性损伤。

在第一列(左侧)中,特定蛋白的抗体(单克隆或多克隆)固定在不溶性支持物(如琼脂糖或磁珠)上,随后与含有目标蛋白的细胞裂解物一起孵育。在孵育期间,轻轻搅动裂解物使目标抗原结合到固定抗体上,形成抗原-抗体免疫复合物。随后,将免疫复合物从固相支持物上洗脱,进行目标抗原的性质分析。

也可将游离的未结合抗体加入裂解物中形成免疫复合物,然后利用填料回收复合物。虽然预固定抗体法更常用于IP,但是如果目标蛋白浓度较低、抗体与抗原的结合亲和力较弱,则使用游离抗体形成免疫复合物的方法更好。


用于免疫沉淀的磁珠和琼脂糖树脂

由于IP技术是作为柱式亲和色谱层析的改进方法而开发的,其最初在微量离心管中使用少量(10–25 µL)琼脂糖树脂完成。琼脂糖是不同形状和大小(直径50-150 μm)的海绵样结构。必须通过离心从样品和缓冲液中分离树脂:可以沉淀透明树脂并小心移除溶液,或者使用微量离心过滤管保留树脂并收集离心后管中的溶液。这些限制了琼脂糖IP的可扩展化或自动化程度。

磁性微粒(如Dynabeads™和Pierce™磁珠)已经大幅取代琼脂糖,成为免疫沉淀和其他微量亲和纯化方法的首选支持物。磁性微粒是球形固体,抗体结合仅限于每个磁珠的表面。虽然磁珠不具有多孔中心以增加结合能力的优势,但它们明显小于琼脂糖微珠(直径1-4 μm),可提供足够大的总表面积以满足高容量的抗体结合。

强力磁力架可将磁珠定位到孵育管的侧壁,使其不阻碍细胞裂解物抽吸,避免吸出与磁珠结合的免疫复合物。磁性分离无需离心,从而不会产生离心导致的抗体-抗原结合破坏和目标蛋白损失。这使得从磁珠中手动移液更简单,并且可使用仪器全自动完成磁珠操作程序——甚至可用于96孔微孔板。

下表对免疫沉淀中琼脂糖树脂和磁珠的性能优势进行了对比,后文对此进行了详细介绍。当前论文发表趋势(参见本文数据总结)表明从树脂免疫沉淀向磁珠免疫沉淀的明显转变,从而证明了磁珠的这些优势。

Agarose vs. magnetic beads for performance in immunoprecipitation

免疫沉淀磁珠的优势详解

结合能力和得率 - 由于琼脂糖树脂是多孔(海绵状)的,其具有较大的表面积-体积比,对抗体的结合能力较高。磁珠的外表面光滑无孔。虽然磁珠直径远远小于琼脂糖珠(这有利于提高总表面积),磁珠的理论结合能力要比琼脂糖低。但是,固定在海绵状琼脂糖上的抗体并不总能够与样品中的目标蛋白(通常为大蛋白复合物)结合,并且抗体可能会在洗涤步骤(离心)中流失。相反,结合在磁珠表面的抗体均能与抗原结合,并且抗体很少会在温和的洗涤步骤(磁体)中丢失。因此,尽管磁珠的抗体结合能力低于琼脂糖,但最终的抗原得率通常与琼脂糖相等或比琼脂糖更高。

可重复性和纯度 - 使用琼脂糖时,难以在不破坏和靠近一些沉淀树脂的前提下完全移除缓冲液。使用磁珠和磁体时,所有磁珠固定在管壁,所以无需碰触磁珠沉淀即可移除缓冲液。此外,琼脂糖通常需要较长的孵育时间(使溶液向内部空间的扩散)和预纯化步骤(控制非目标蛋白的非特异性结合)。由于所有的相互作用均发生在磁珠的外表面,并且磁珠的尺寸更均一,所以磁珠的可重复性和纯度通常高于琼脂糖。磁珠一般不需要预纯化步骤。

简单、快速和自动化 - 琼脂糖和磁珠之间的上述差异正是目前免疫沉淀优先选择磁珠的原因。由于琼脂糖免疫沉淀需要较长的孵育时间、预纯化步骤和多次离心,所以其需要大量手动操作,总时间为1-1.5小时。相反,一次磁珠免疫沉淀使用只需大约30分钟即可完成。

此外,由于磁性分离不需要离心,在处理多个样品时更简单、更快速。例如,使用DynaMag™-2 Magnet(货号12321D)和配套样品架(货号12322D),可在微量管中用磁珠轻松同时处理16个样品。磁体也适用于96孔板(如,货号12027)。事实上,使用小型台式仪器,如KingFisher™ Flex磁珠处理仪(货号5400630),可自动完成全部磁珠免疫沉淀操作过程。


免疫沉淀微珠选择总结

使用磁珠进行免疫沉淀(即,当样品体积< 2 mL)。在日常小型分离特定蛋白质和蛋白复合物时,磁珠可实现结合能力/得率、可重复性、纯度和成本节约之间的平衡。当进行手动和自动化标准IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP和pull-down反应并立即用于后续检测分析时,磁珠是最佳选择。

使用琼脂糖树脂进行蛋白质纯化(即,当样品体积> 2 mL)。当大量抗体成本较低并且想要纯化大量目标蛋白用于多种下游分析时,琼脂糖最适用于柱亲和色谱或独立大型旋转杯免疫沉淀反应。


免疫沉淀的类型

最简单的IP可用于分离单个蛋白(抗体的靶抗原)以研究其特性、结果、表达或活化或修饰状态。IP也用于研究初级抗体蛋白与其他蛋白或核酸的相互作用。这些方法的目的是研究与初级抗原结合的相互作用物或相关细胞组分。

免疫共沉淀(Co-IP)

免疫共沉淀是研究蛋白质相互作用的常用技术。Co-IP与IP的操作方法基本相同,除了利用抗体共沉淀裂解物中共与抗原结合的配体或相关蛋白复合物。通常,在相关蛋白共沉淀时,假设这些蛋白与目标抗原在细胞水平上的功能相关。但是,这只是一个假设,有待进一步验证。


染色质免疫沉淀(ChIP)和RNA免疫沉淀(RIP)

染色质免疫沉淀分析可用于鉴定基因组中与DNA结合蛋白(如转录因子和组蛋白)结合的区域。在ChIP分析中,在细胞裂解前,使蛋白质与DNA暂时交联固定并剪切DNA。目标蛋白与交联的核苷酸序一起免疫沉淀,取出DNA并进行PCR鉴定、测序、微阵列分析或采用其他方法进行检测。RIP与ChIP相似,除了RNA结合蛋白被免疫沉淀而非DNA结合蛋白。随后,通过RT-PCR和cDNA测序对免疫沉淀所得的RNA进行鉴定。


标签蛋白IP或基于标签的pull-down

前述IP方法的一个关键局限是,它们依赖能够特异性识别靶蛋白的抗体,需要靶蛋白很少或绝不能其它胞内靶标发生交叉反应。限于这一条件,很多蛋白质由于无法找到可用的抗体而无法进行免疫沉淀。

为了规避这一问题,可以采用一个表位标记标记蛋白质(该表位可在您感兴趣的细胞内组成型表达,并具有高亲和度抗体)。如今,这一方法已经成为所有类型的分子生物学研究免疫沉淀的补充。这些标签可以是短链肽或荧光蛋白,包括:

  • Flag;肽序列DYKDDDDK
  • c-Myc;肽序列EQKLISEEDL
  • 血细胞凝集素 (HA) ;肽序列YPYDVPDYA
  • 绿色荧光蛋白(GFP)

使用标记蛋白的一个缺点是过表达的标记蛋白(而非内源性蛋白)被免疫沉淀,这就限制了这种方法在真正的生物学相关性研究之中的应用。此外,标记蛋白还可能影响蛋白功能。

但根据附加表位标记和荧光酶标记的蛋白质,可通过定量免疫沉淀方法精确测定影响培养细胞之中特定蛋白质-蛋白质相互作用的生长因子和条件。


抗体固定策略
抗体结合蛋白质

蛋白A、蛋白G,蛋白A/G和蛋白L是免疫球蛋白(Ig)结合蛋白,作为亲和配体与固相支持物结合时,是适合IP应用的最常用抗体结合平台。如下方示意图所示,蛋白A和G可与抗体重链的Fc区段特异性地结合,实现分子高效定向,抗体结合位点朝外;蛋白G也优先结合Fc区段(1,3)。蛋白L可结合轻链,但受制于自身的特殊的结合特性,蛋白L仅可用于有限的应用。

大多数免疫沉淀采用蛋白A、蛋白G或蛋白A/G进行,后者是一种结合了四种蛋白A和两种蛋白G抗体结合位点的工程改造重组蛋白。蛋白A和G均对对多种不同亚类和种属的抗体具有高亲和力,所有分别能与蛋白A和G结合的抗体亚类均可与蛋白A/G结合。

蛋白A、G和A/G(此后统称为“蛋白A/G”)是将抗体结合到固相支持物上以用于IP应用的高效工具(图3)。蛋白A/G树脂的创新,使研究人员开发出了商品化的高结合性能支持物,只需少量体积的树脂即可获得极佳的免疫沉淀结果。

Immobilize antibodies with Protein A/G beads for immunoprecipitation 蛋白A/G介导的抗体固定到固相支持物上的示意图,蛋白A/G(或蛋白A或蛋白G)结合到IP抗体的Fc区段,将其固定到正确的正确的方向,以便免疫沉淀靶标抗原。

蛋白A/G支持物不适合某些特定的IP实验系统,例如,当IP抗体的种属或亚类不与这些蛋白结合,或者当含有抗原的样本是血清时(血清之中包含的免疫球蛋白会与IP抗体竞争结合)。


带有生物素化抗体的链霉亲和素微珠

很多一抗都提供商业化的生物素化形式,即便不提供,实验室研究人员也可使用现成的试剂或试剂盒轻松地对其进行生物素标记。在IP之中使用生物素化的抗体时,用链霉亲和素微珠进行捕获(固定)无疑是最佳选择。此外,由于很多蛋白质或核酸可以生物素化,对于所有类型的pull-down反应,亲和素-生物素系统都不失为强大、多功能的策略。

Biotinylated antibodies and streptavidin beads for IP
图示为使用生物素化的抗体和链霉亲和素偶联的微珠进行免疫沉淀。此策略可用于无法顺利和蛋白A或G结合的IP抗体。此外,对于任何类型的生物素化分子,pull-down反应效率都很高。

共价连接抗体的固定化

共价固定策略将抗体化学结合到微珠支持物上,去除了依赖蛋白A/G的抗体固定要求。目前可采用商业化的产品提供与抗体上的伯胺(-NH2)反应,从而将抗体永久结合到支持物上的微珠支持物。尽管这种方法会是随机结合抗体(基于表面伯胺基团与反应性醛基的接触),但通常只对IP抗体的抗原结合功能和性能产生微弱的影响。这种直接固定的方法不仅可以避免对蛋白A/G的依赖,而且可以避免IP抗体与抗原一起被洗脱下来(使用非还原性洗脱液),避免干扰SDS-PAGE分析。此外,由于抗体理论上仍保持完整并与支持物永久结合,抗体包被的支持物可以反复使用很多次。

Direct method to covalently immobilize antibody to IP beads 图示为将抗体直接共价链接到固相支持物上。该图采用了乙醛活化的琼脂糖树脂,采用固定原理与环氧活化Dynabeads及其它磁珠相同。

使用交联剂的抗体固定化

除了直接固定外,还可以交联剂将抗体共价连接到蛋白A/G支持物上。常用的交联剂包括DSS和BS3,它们均为末端带有胺基反应性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团的短碳链。NHS酯可与伯胺(赖氨酸残基的侧链)反应,生成共价酰胺键。如果抗体先与蛋白A/G支持物结合,然后再与交联剂溶液混合,则交联剂分子可与抗体和蛋白A/G相邻的胺基共价连接。

Crosslinking to immobilize antibody to IP beads 图示为使用交联剂将抗体共价固定到蛋白A/G包被的固相支持物。此图采用琼脂糖珠,但其固定原理与Dynabeads及其他磁珠相同。

与直接固化方法一样,交联方法可以避免抗体片段共洗脱,抗体支持物可以重复多次使用。该方法只适用于可与蛋白A或G结合的抗体。由于抗体包含多个胺基基团,且不仅只分布于Fc区段,因此必须优化交联剂的用量。如果交联剂用量过少或过多,则抗体可能无法连接至蛋白A/G琼脂糖上,或者引起抗体结合位点上的胺基基团被过度修饰,进而导致抗体无法与抗原结合。


IP缓冲液及其优化

尽管就逻辑和程序而言免疫沉淀的方法十分简单,但由于不同的蛋白质和不同的一抗之间可能存在各种特殊差异,因此影响实验成功的变量和因素不仅多且各不相同。通常都需要进行预实验,并不断优化实验条件,才能最终分离获得数量和纯度均满足要求的特定蛋白质。如果能够预先考虑这些变量可能带来的影响,对于确定特定免疫沉淀实验中的关键要素大有帮助(例如免疫沉淀或免疫共沉淀实验设置对照);任何通过这些对照条件获得产物都可能造成非特异性(脱靶)相互作用。上述直接固定方法的一大优势是不使用蛋白A/G元件,而蛋白A/G则是检测体系内非特异性结合产生的潜在来源。

裂解缓冲液

免疫沉淀所用的样品质量很大程度受制于裂解液,优质的裂解液可以稳定天然蛋白构象、抑制酶活性、最大限度避免结合位点变性同时从细胞或组织最大限度解离蛋白质。免疫沉淀的靶标蛋白与所用的裂解液不无关联,因为细胞内的蛋白位置(例如,膜、细胞质、细胞核)会影响裂解过程的解离难度,从而影响裂解液的选择。

当IP靶标蛋白可溶于去垢剂且抗体可以识别天然蛋白时,采用非变性裂解液。这一类缓冲液含有非离子除垢剂,例如NP-40或Triton X-100。变性裂解液,例如放射免疫沉淀实验(RIPA)缓冲液,则加入了离子除垢剂(例如,SDS或去氧胆酸钠)而比非变性裂解液更为强效。变性裂解液不会维持天然蛋白构象,在非变性裂解液之中无法解离的蛋白质(如核蛋白)可以通过变性裂解液解离。这两种裂解液均含有NaCl和 Tris-HCl,同时具有弱碱性pH(7.4-8)。如果仅使用物理破碎方法(例如机械均质或加热)可以使靶标蛋白从细胞上释放,不含去垢剂的裂解液可以用在此类蛋白抽提方案中。这一类简单的裂解液通常含有溶于磷酸盐缓冲液(PBS)的EDTA。有关实验方案优化的各个要素请见下表。

由于细胞裂解液还含有可修饰或变性靶标蛋白的蛋白酶和磷酸酶,大多数免疫沉淀试验方案在4°C下进行。 PMSF、抑酞酶、亮抑酞酶等蛋白酶抑制剂常在裂解液使用前添加到裂解液中,同时还会加入正钒酸钠或氟化钠作为磷酸酶抑制剂。尽管这些成分可以单独加入,但我们也提供更高质量、更易用的商业化抑制剂混合物。

优化条件的IP缓冲液成分浓度范围(2).
成分 浓度范围
非离子除垢剂 (NP-40, Triton X-100) 0.1 - 2%
离子除垢剂(SDS、去氧胆酸钠) 0.01 - 0.5%
NaCl(氯化钠,食盐) 0 - 1M
二价阳离子 0 - 10mM
pH 6 - 9
EDTA 0 - 5mM

样品预纯化(磁珠法可选)

由于细胞裂解物是包含蛋白质、脂质体、糖及核酸的复杂混合物,通常必须要假定其中可能含有与IP抗体、蛋白A/G或磁珠支持物的非特异性结合的成分,这影响到免疫沉淀靶标蛋白的检测。

预纯化可在正式进行免疫沉淀操作之前,从裂解物中去除可能存在的非特异结合成分。使用琼脂糖树脂时,预纯化通常必不可少,但是使用磁珠时则很少用到(参见下方视频)。

预纯化的基本方法是将裂解物与免疫沉淀的相同成分一起(但是使用了非特异性抗体,此抗体与IP抗体来自同一物种)孵育。这样会形成非特异性复合物并固定到固相支持物上:如果使用蛋白A/G或琼脂糖微珠,此方法可让IP成分非特异性结合,同时从裂解物之中去除非特异性免疫复合物。如果预纯化成功,则可以去除非特异性裂解物,从而在避免了在正式的IP实验中与靶标蛋白(抗原)一起被纯化出来。

非特异性免疫复合物可用作IP或co-IP实验的阴性对照;在这些对照条件下获得的产物均来自于非特异性(非靶向)相互作用。上述直接固定抗体方法的优点之一是可以完全避免使用蛋白A/G组分,从而去除可能由蛋白A/G引起的非特异性结合。

结合和洗涤缓冲液

在免疫沉淀过程中,免疫复合物的形成及稳定性维持取决于结合缓冲液与所有组分之间结合反应的兼容性。在大多数情况下,抗体-抗原相互作用比较稳定,可在任意一种近中型pH的标准缓冲液中进行,如PBS。相反,诱饵蛋白-靶蛋白相互作用的强度和时间则不确定,可以是长期不可逆的结合,也可以是瞬时且不稳定的结合,会受到结合条件和前期选择的实验方案影响。

即便在裂解物预纯化后,免疫沉淀成分还会与非特异性细胞裂解物结合,这些非特异性结合物必须在样品洗脱前温和冲洗掉。采用简单的缓冲液(例如单用PBS,搭配低浓度去垢剂,或者温和调节盐浓度)多次洗涤,可用于去除此类污染物。

洗脱缓冲液

如果传统的IP下游分析使用还原性SDS-PAG和蛋白质免疫印迹(Western Blotting)检测,则通常直接使用还原性SDS-PAGE上样缓冲液进行洗脱。该缓冲液可使蛋白质变性还原并用于电泳,十分高效,适用于亲和作用的解离。但如果IP和其他下游应用与该缓冲液系统不兼容,或者当使用该洗脱缓冲液时,某些IP方法的优点也体现不出来(例如,直接或交联IP方法中的抗原洗脱液无抗体片段污染),就要考虑更换或者优化洗脱缓冲液。

蛋白亲和纯化方法中的最高效非变性洗脱缓冲液是0.1 M 甘氨酸,pH 2.5-3。低pH水平可以解离大多数抗体-抗原相互作用(以及假定未交联的情况下的抗体-蛋白A/G相互作用)。低pH甘氨酸体系并非通用,采用该缓冲液无法解离某些抗体-抗原相互作用,此外,一些抗体和靶标抗原还会在该缓冲液中变性或失活。研究人员开发出了一些其它类型的洗脱缓冲液,详见以下文件。


视频

以下视频专门涉及Dynabeads磁珠,汇总了上述有关免疫沉淀的信息。它们还展示了使用磁珠代替琼脂糖树脂进行免疫沉淀的几大优势。


参考文献
  1. Bjorck L. and Kronvall G. (1984) Purification and some properties of streptococcal protein g, a novel IgG-binding reagent. J Immunol. 133, 969-74.
  2. Harlow, Ed, and Lane, David. (1999) Using Antibodies. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  3. Wikstrom M. et al. (1995) Mapping of the immunoglobulin light chain-binding site of protein l. J Mol Biol. 250, 128-33.