详细了解Thermo Scientific一步法IVT产品特点和类型

Thermo Scientific一步法人体外翻译系统是一种从DNA或mRNA模板表达蛋白质的方法,用于在包含细胞翻译机制基本成分的无细胞溶液中进行翻译。永生人类细胞系提取物提供了核糖体、起始和延伸因子、tRNA和其他蛋白质合成所需的基本成分。当补充专有的辅助蛋白、ATP和能量再生系统时,这些提取物维持从DNA模板合成目标蛋白长达6小时,无需移除产品产生的抑制作用。


简介和实验方案概述

1步法人体外翻译试剂盒

1步法人IVT试剂盒使用人类细胞裂解物合成蛋白质。相对细菌(大肠杆菌)或者其他(如昆虫、小麦胚芽和兔网织红细胞裂解物)系统,体外蛋白表达使用人类细胞提取物,能够在数小时内生成功能性蛋白质。使用DNA或mRNA模板都能实现表达,模板可以来自载体,或者通过我们的基因开放阅读框架库获得。</p> <p>体外蛋白表达的优点包括与微升级规模反应的相容性,以及相对于传统基于细胞方法的速度(细菌培养需要过夜,杆状病毒蛋白质制备需要数周)。这种小规模表达方法可以很容易在微孔板中同时表达大量突变变异,或者为未来的实验表达大数量的单一蛋白质。小规模合成也能帮助避免蛋白质聚集成包涵体,这是细菌表达系统的典型问题。此外,体外表达蛋白质也能合成无法在活细胞中生产的毒性蛋白质。此蛋白质表达系统可以表达来自任何物种的蛋白质,并且已经在许多来源原核和真核的基因中得到验证。

亮点:

  • 功能性 – 使用人类翻译机制来表达活性蛋白质
  • 使用方便 – 在同一步骤中进行转录和翻译
  • 高性能 – 与兔网织红细胞体外翻译相比更高产量
  • 可靠 – 可以表达的在兔网织红细胞系统无法表达的蛋白质

优于传统方法:

  • 不含细胞的海拉细胞提取物能够表达带有翻译后修饰的蛋白质
  • 准确翻译获得全长蛋白质,与下游应用兼容
  • 蛋白质翻译经过EMCV IRES元件和其他mRNA稳定化元件优化
|1步法人偶联IVT试剂盒实验方案概述| 只需将适当的模板添加到HeLa细胞裂解液混合物、辅助蛋白质、反应混合物混合物之中,然后在30°C下温育90分钟,即可获得高达100µg/mL的蛋白得率。小反应体积非常适合于微孔板形式的突变变异表达。可增加反应体积和时间以表达大量的单一种类蛋白质,从而供多项下游应用使用。

可选的人IVT试剂盒选择表

可选的Thermo Scientific一步法人IVT试剂盒

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人IVT表达蛋白质的应用和功能研究

酶活性和蛋白质相互作用的蛋白质功能分析可能有一些障碍。例如,缺少好的抗体可能造成在免疫共沉淀和电超迁移率实验中,无法识别和验证复杂样品中的蛋白质。在某些特定检测中,低表达水平可能会对富集目标蛋白质的能力造成负面影响。这些问题能够通过使用体外表达蛋白克服,但很多无细胞蛋白表达系统缺乏产生高水平的功能性蛋白的能力和保真性。对于恰当翻译后修饰至关重要的真核蛋白质,这个问题非常复杂。

蛋白质相互作用和人类IVT系统

了解蛋白质功能经常需要检测它和其他生物分子间如何相互作用,比如DNA、RNA和其他蛋白质。蛋白质-核酸(DNA或RNA)相互作用可以通过电泳迁移位移试验(EMSA)监测,以助于阐明从细胞复制到凋亡的调控机制。蛋白质-蛋白质相互作用可通过免疫共沉淀和下拉实分析,有助于识别新型结合伙伴。

对于蛋白质相互作用检测,体外翻译蛋白质免于从活细胞提取蛋白质,并且有助于快速高效地筛选多种蛋白质同种型或变异的能力。下面是一些使用人类IVT系统生成的重组蛋白用于蛋白质相互作用检测的例子。

A. 蛋白质间相互作用:免疫共沉淀检测

|采用体外表达的HA标记CDK2检测CDK2-cyclin E1相互作用。| 重组CDK2 通过人IVT系统表达,后者是一种含有内源性细胞周期素E1的Hela细胞裂解液成分。HA标记的CDK2或非DNA对照进行体外翻译反应,每次反应使用200μL体积与抗周期素E1一抗进行免疫共沉淀。之后再回收并洗脱富集的CDK2-cyclin E1 复合物。通过免疫印迹法分析洗脱物 (12μL)和体外翻译反应混合物(9uL),通过抗HA抗体检测HA标记的CDK2。

B. 蛋白质-DNA相互作用分析:凝胶偏移分析

|采用体外翻译CREB检测CREB-DNA相互作用。|通过使用LightShift Chemiluminescent DNA EMSA Kit在PC12细胞裂解物或人体外翻译反应(CREB及载体对照)中可以对CREB的DNA结合活性进行检测。DNA-蛋白质反应体系按照10mM Tris-HCI pH 8.0, 50mM NaCl, 5mM EDTA, 25% glycerol, 0.05% NP40, 8mM spermidine及1mM DTT进行制备。在注明的步骤处加入未标记的寡核苷酸(4pmol),并在室温下将反应体系孵育5分钟。然后加入生物素标记的寡核苷酸探针,继续孵育30分钟。在0.5X TBE中的5% TBE凝胶上使用100V在4°C下电泳2小时来分离复合物,之后在45V下转膜30分钟至Biodyne B尼龙膜(Part No. 77016)(槽转膜)。然后对复合物进行交联固定,并使用Pierce Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module (货号 89880)对生物素进行检测。

C. 蛋白-RNA相互作用分析:RNA凝胶偏移分析

|采用人IVT系统检测蛋白质-RNA相互作用。|通过使用LightShift Chemiluminescent RNA EMSA Kit(货号20158)在凝胶偏移分析中对Aco1的RNA结合能力进行分析,Aco1由Human IVT Kit System通过体外翻译进行制备。使用0.5mL Zeba 离心脱盐柱(Part No. 89882)将Aco1翻译反应体系离子交换至1X REMSA缓冲液中,然后在4°C条件下使用30µL高结合链霉亲和素琼脂糖珠(货号20361)进行预纯化30分钟。对预纯化后裂解物进行1:20稀释,取用2µL与5nM生物素标记的IRE-RNA孵育在含5%甘油的1X REMSA缓冲液中。反应完成后加样至6%聚丙烯酰胺凝胶在0.5X TBE中进行电泳,然后转膜至Biodyne B尼龙膜(货号77016)。使用Pierce Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module(货号89880)对条带偏移进行检测。1号泳道:仅含生物素标记IRE-RNA探针的反应体系(阴性对照)。2号泳道:IRE-RNA探针的条带偏移,表明在添加体外翻译Aco1后探针与Aco1结合。3号泳道:通过添加200倍摩尔浓度的未标记IRE-RNA与标记探针对Aco1进行竞争性结合。4号泳道:添加200倍摩尔浓度的未标记非特异RNA探针与标记探针未发生竞争性结合。

蛋白质功能和人IVT系统

体外翻译实验对于生成用于高通量突变分析或小分子筛选的蛋白质,非常理想。这些检测通常需要浓缩的纳克到微克级的蛋白质,用于在多孔板中进行分析。人类IVT系统反应可以缩小规模,用于96孔板(标准25µL反应容量)或384孔板(10µL反应容量),不会损失蛋白质/mL相对产出。这个特点使得用户可以直接在多孔板中进行PCR介导的突变分析(参见PCR实验方案),以及快速筛选由体外翻译生成的蛋白质突变库。

对于小分子筛选,体外翻译可以在多个微孔中表达同一种蛋白质,然后使用不同小分子处理,如下面所示,使用已知蛋白质翻译抑制剂。

示例:caspase-3表达和功能

|采用人IVT系统表达的Caspase-3相比纯化自细菌的更具有活性。|将纯化自E. coli的人caspase-3与用一步法人高得率IVT试剂盒获得的caspase-3取相同的量,使用Caspase-glo™ Assay Reagent混合可剪切的DEVD-氨基荧光素与荧光素酶底物对活性caspase-3的活性进行分析,实验流程依照制造商(Promega Corp.)的说明进行。
|采用人IVT系统进行小分子筛选。|使用384孔板制备体外翻译反应体系,对不同化合物依照其影响蛋白合成的能力进行分类。在该反应体系中,荧光素酶mRNA作为体外翻译对照,单独表达荧光素酶蛋白,或分别添加4%二甲基亚砜(DMSO)、10µg/mL环十二碳三烯、1mM十字孢碱或400µg/mL的新霉素(G418)后进行表达。整个表达过程在30°C下进行3小时,然后在Thermo Scientific Varioskan Flash I仪器上对荧光素酶报告分析的结果进行测定,从而得到荧光素酶蛋白表达水平。

表达的蛋白类型

Traditional in vitro translation systems have limitations in the types of proteins that can be generated, because they based on cell-free extracts from bacteria, insect or other non-mammalian sources that require the addition of ectopic components. The Human IVT System uses human HeLa cell extract, which endogenously contains the enzymes required for protein synthesis and proper post-translational modification. Therefore, many types of proteins that can be expressed using the Human IVT Kits.

传统体外翻译系统在可以生产的蛋白质类型方面有局限性,因为它们是基于细菌、昆虫或其他非哺乳生物来源的无细胞提取物,需要添加外来元素。人类IVT系统使用人类海拉细胞提取物,其内源性地包含蛋白质合成和恰当翻译后修饰所需的酶。因此,许多蛋白质类型都可以使用人类IVT试剂盒表达。

表达广泛分子量范围的蛋白质

蛋白质的稳定性、折叠和溶解性都能影响其成功表达。高分子量蛋白质难以在体外表达,因为其有更大的几率出现过早终止,以及相对于较小蛋白质更复杂的三级结构,这会提高不正确折叠的概率[1,2]。此外,更大尺寸的蛋白质拥有较大疏水区,在E. coli提取物中表达时,会促进包涵体的形成。一步法人体外翻译系统可以用于生产尺寸范围广泛的蛋白质。

|使用人体外翻译系统得到的蛋白大小分布。|将一百种大小从8kDa到超过250kDa的蛋白分别使用人体外翻译系统进行表达,成功率达95%。

表达磷酸化蛋白

一步法人IVT系统使用海拉细胞裂解物进行无细胞蛋白质表达。使用基于人类的系统能够获得与天然蛋白质翻译后修饰方面一致的蛋白质, 从而获得表现天然蛋向质功能和结构的蛋白质。激酶免疫印迹检测显示,人IVT系统表达了一种蛋白质,但总蛋白质检测不能显示这种蛋白功能正常。因此功能性的指示,三种激酶(Aurora A、ERK1和Akt)的磷酸化状态也使用磷特异性抗体Western blot进行验证。体外翻译Akt的磷酸化状态在尺寸上,与在源于血小板的生长因子(PDGF)活化的NIH3T3成纤维细胞中一致,这说明人类IVT系统能够生产与体内功能上类似的激酶。

|采用一步法人体外翻译系统对磷蛋白进行表达。|使用人IVT系统对8种不同的HA标记的激酶进行表达,结果使用抗HA抗体通过免疫印迹分析进行检测。可检测到与相应激酶分子量对应的条带,表明蛋白可以正常表达。在共表达GSK3α和GSK3β时可检测到双合条带,而在阴性对照(无DNA)道中则检测不到信号。
|采用一步法人体外翻译系统制备功能性激酶。|对不同体外翻译反应体系中获得的Aurora A及ERK1进行免疫沉淀,分别使用抗磷酸化Aurora A (T288)和抗磷酸化ERK 1/2 (T202/Y204)的抗体通过免疫印迹分析均可检测到磷酸化蛋白,表明这两种蛋白均具有功能性。之后进行脱膜,并分别使用泛特异性抗体对总蛋白水平进行检测。同时对未免疫沉淀的反应体系及无DNA对照也进行分析。从未免疫沉淀的体外翻译反应中可直接检测到Akt的磷酸化,并与PDGF刺激的NIH3T3细胞中内源Akt的磷酸化进行对比。按照如上所述对Aurora A及ERK1的操作使用SDS-PAGE及免疫印迹分析对磷酸化Akt和总Akt进行检测,其中使用了抗磷酸化Akt(S473)及抗泛Akt抗体。1、无DNA对照;2、未免疫沉淀人体外翻译反应体系;3、免疫沉淀的HA标记激酶;4、PDGF刺激的NIH3T3细胞裂解物。

表达糖蛋白

采用最广泛的体外翻译方法是兔网织红细胞裂解物[3]。虽然这个策略能够进行不依赖5'端帽的翻译,但如果不加入犬微粒体膜,初生蛋白的翻译后修饰如N-糖基化就无法出现,微粒体膜是细胞破裂后形成的囊泡状内质网(ER)残余。虽然兔网织红细胞裂解物和微粒体膜能够生产糖基化蛋白,但这种方法严重减少了蛋白质产量。

我们为您提供一步法人偶联IVT试剂盒标准方案的改编方案,优化表达N-糖基化蛋白质。

|采用人IVT系统对N连接糖蛋白进行表达。|分别将HA标记的HCGβ, ORM1或EPO的DNA(0.1或0.2μg)加入至25μL耦连人IVT反应体系中并在26°C下孵育4小时。反应体系根据制造商说明分别使用或不使用Endo H进行处理,使用SDS-PAGE凝胶对蛋白进行分离并使用抗HA抗体通过免疫印迹对HA标签进行检测。可得到对应的糖基化蛋白(三角标签)及未糖基化蛋白(最低条带)的位置。Endo H可完全去除所有N端连接的甘露糖残基,从而使蛋白以单一条带形式出现。在使用较低的DNA浓度时糖基化vs.非糖基化蛋白的相对比例明显较高。

表达膜蛋白

膜蛋白通常最难纯化,因为它们的疏水性跨膜区域能够造成大量体外翻译蛋白聚集和沉淀。但是使用人类体外翻译系统合成具有不同数量跨膜区域的膜蛋白,包括疏水GypB/E、类线粒体外膜Bcl2蛋白Bcl2L1和趋化因子受体CXCR4。此外,几乎所有蛋白质都存在于可溶性部分而非沉淀物内,说明合成的膜蛋白没有聚集和沉淀在溶液之外。

一步法人体外翻译系统中使用的较慢的氨基酸添加以及膜富集的海拉提取物,被认为有助于强化蛋白质折叠和膜蛋白的可溶性。此外,微克级水平的蛋白质表达也被认为可以阻止初生蛋白浓度增长超过一个阈值,促进聚集影响细菌表达。使用大肠杆菌提取物的其他系统通常拥有高的多的氨基酸添加率,更高的蛋白质产量,但是较低的膜蛋白浓度,因为降低了折叠效率所以提高了蛋白质聚集的几率[6,7]。类似的,获得毫克规模数量膜蛋白的体内表达方法,经常会导致包涵体的产生,这占有时间,并难降解成可溶性蛋白的蛋白质聚集物。

|采用一步法人体外翻译系统表达可溶膜蛋白。|使用一步法人偶联IVT系统对HA标记的GypB/E, Bcl2L1及CXCR4等膜蛋白进行表达。从总反应混合物(T)中分别提取10µL样品进行分析,并通过离心分离得到上清(S)和沉淀(P)组分,之后使用抗HA抗体通过免疫印迹分析对相应蛋白质进行检测。印迹上方的图片分别为每种蛋白的跨膜域数量。箭头标明了每种蛋白条带。

同一反应中多种蛋白共表达

进行不同蛋白质的共表达,可以用于检测由于突变分析或小分子处理造成的结合亲和力改变,一步法人类IVT系统可以在单一翻译反应中共表达多种蛋白质。使用人类体外表达系统,一次反应中曾表达多达五种HA标记的蛋白质。

|一步法人体外翻译系统可对多种蛋白质进行共表达。|将5种HA标记的蛋白分别进行翻译(泳道1-5)或在单一反应体系中在30°C条件下进行4小时共表达。之后使用4-12%的SDS-PAGE对反应体系进行分离,然后使用抗HA抗体通过免疫印迹分析进行检测。所选蛋白质是基于其分子质量,从而证明该系统可表达不同大小的蛋白质。