Long non-coding RNAs (lncRNA)

长非编码RNAs(lncRNAs)是哺乳动物转录组中含量丰富的一类非编码RNA,通常长度超过200nt。它们已被证明能调节细胞功能,包括细胞信号、肿瘤发展和代谢调节。用siRNA敲低lncRNA是确定lncRNA的功能和意义的有效方法。然而由于他们的细胞位置和二级结构的原因,可能是具有挑战性。Silencer Select lncRNA siRNAs设计用于克服这一挑战:

  • 锁核酸技术(LNA)帮助获得高特异性和减少脱靶效应 
  • Silencer Select技术能够设计出更加准确的结果、低毒性、更高效力的siRNA

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Silencer Select lncRNAs siRNAs具有以下特征

  • 更全的产品组合,针对5000多个lncRNA靶标的Silencer Select siRNAs
  • 使用包括Gencode v27在内的数据库验证lncRNA基因座、伪基因座和选择性剪接转录本的最佳覆盖率
  • 预设计的siRNA与现有的TaqMan非编码检测试剂盒非常匹配

Silencer Select lncRNA siRNAs 高效敲低

对HeLa和HEK293T细胞的靶向敲低结果表明,两个或多个siRNA得到至少50%的敲低效果。对于七个靶标中的六个,获得了80%以上的敲低效率。敲低对具有核或胞质定位的lncRNA有效。

Efficient knockout of lncRNAs

图 1:在25 nm的浓度下,每个基因共检测5个不同的siRNA。以复孔的方式进行转染,使用Invitrogen Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂 (货号13778150) 将每个siRNA转染至96孔板中的1X104的HeLa或HEK293T细胞中。细胞转染后48小时,进行cDNA合成,然后使用 TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit (货号. AM1728)TaqMan Gene Expression Assay (FAM) (货号. 4331182)进行基因表达谱分析。进行三组平行TaqMan qPCR检测,剩余的表达使用打乱的(Scr)阴性对照siRNA(Scr siRNA)转染的样品进行标准化。结果表明,所有靶点有至少2个敲低的siRNA。

siRNA转染后细胞存活率的维持

单独或与siRNA结合的转染试剂可能导致细胞活力的非特异性下降。这可能会影响对敲低结果的原因分析。将5种针对7种不同lncRNA的siRNA转染到指示细胞中。没有发现存活率显著下降。

siRNA transfection

图 2:用 Lipofectamine RNAiMAX转染试剂以96孔板形式转染1×104 HeLa或HEK293T细胞。转染后48小时和使用TaqMan Real-Time PCR试剂盒进行分析,使用 PrestoBlue 细胞活性试剂(Cat.A13261)进行细胞活性分析。用没有任何siRNA的Lipofectamine RNAiMAX转染试剂处理的样品,对细胞存活率进行归一化处理。

案例研究:使用Ambion Silencer Select产品线设计的多个siRNA进行核定位lncRNA——MALAT-1的高效敲低

肺腺癌转移相关转录本1(MALAT-1)是11号染色体上表达的一种lncRNA,已知在多种人类癌症中表达失调。MALAT-1lncRNA在细胞核中表达,其高表达与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。

使用实时定量PCR(qRT-PCR)进行MALAT-1特异性非编码TaqMan分析(Hs00273907_s1),证实MALAT-1在多种常见人细胞系(HeLa、A549、HEK293、Jurkat、U2-OS、MCF7和HuH7)中高水平表达。

用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂将抗MALAT-1的siRNA转染至HeLa和A549细胞。采用实时PCR方法检测细胞敲低率。我们从HeLa细胞中获得的数据表明,siRNA在30nM时能够使MALAT-1沉默80%或更高,这种作用在转染后24小时就发生了,并持续到5天。Northern印迹分析进一步证实了敲低效果,表明MALAT-1转录水平显著降低,这与qRT-PCR的敲低测定一致(图3)。

Silencer Select siRNAs

图 3:应用多种Silencer Select siRNAs 对HeLa细胞中核定位MALAT-1ncRNA进行高效敲低,并通过Northern分析对结果进行验证。

Silencer Select lncRNA siRNAs 高效敲低

对HeLa和HEK293T细胞的靶向敲低结果表明,两个或多个siRNA得到至少50%的敲低效果。对于七个靶标中的六个,获得了80%以上的敲低效率。敲低对具有核或胞质定位的lncRNA有效。

Efficient knockout of lncRNAs

图 1:在25 nm的浓度下,每个基因共检测5个不同的siRNA。以复孔的方式进行转染,使用Invitrogen Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂 (货号13778150) 将每个siRNA转染至96孔板中的1X104的HeLa或HEK293T细胞中。细胞转染后48小时,进行cDNA合成,然后使用 TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit (货号. AM1728)TaqMan Gene Expression Assay (FAM) (货号. 4331182)进行基因表达谱分析。进行三组平行TaqMan qPCR检测,剩余的表达使用打乱的(Scr)阴性对照siRNA(Scr siRNA)转染的样品进行标准化。结果表明,所有靶点有至少2个敲低的siRNA。

siRNA转染后细胞存活率的维持

单独或与siRNA结合的转染试剂可能导致细胞活力的非特异性下降。这可能会影响对敲低结果的原因分析。将5种针对7种不同lncRNA的siRNA转染到指示细胞中。没有发现存活率显著下降。

siRNA transfection

图 2:用 Lipofectamine RNAiMAX转染试剂以96孔板形式转染1×104 HeLa或HEK293T细胞。转染后48小时和使用TaqMan Real-Time PCR试剂盒进行分析,使用 PrestoBlue 细胞活性试剂(Cat.A13261)进行细胞活性分析。用没有任何siRNA的Lipofectamine RNAiMAX转染试剂处理的样品,对细胞存活率进行归一化处理。

案例研究:使用Ambion Silencer Select产品线设计的多个siRNA进行核定位lncRNA——MALAT-1的高效敲低

肺腺癌转移相关转录本1(MALAT-1)是11号染色体上表达的一种lncRNA,已知在多种人类癌症中表达失调。MALAT-1lncRNA在细胞核中表达,其高表达与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。

使用实时定量PCR(qRT-PCR)进行MALAT-1特异性非编码TaqMan分析(Hs00273907_s1),证实MALAT-1在多种常见人细胞系(HeLa、A549、HEK293、Jurkat、U2-OS、MCF7和HuH7)中高水平表达。

用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂将抗MALAT-1的siRNA转染至HeLa和A549细胞。采用实时PCR方法检测细胞敲低率。我们从HeLa细胞中获得的数据表明,siRNA在30nM时能够使MALAT-1沉默80%或更高,这种作用在转染后24小时就发生了,并持续到5天。Northern印迹分析进一步证实了敲低效果,表明MALAT-1转录水平显著降低,这与qRT-PCR的敲低测定一致(图3)。

Silencer Select siRNAs

图 3:应用多种Silencer Select siRNAs 对HeLa细胞中核定位MALAT-1ncRNA进行高效敲低,并通过Northern分析对结果进行验证。

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