正确、适当的对照是确保每一次RNAi实验都能获得成功的基本前提。所选的对照数量和类型取决于最终的研究目标(参见下表)。我们提供了一系列RNAi技术选择,简化了对照反应,可协助研究人员鉴别并验证药物靶标、生成报告数据和申请授权。我们的RNAi对照使您可以:

  • 判定哪一种RNAi分子可以呈递最佳的敲低效果
  • 优化转染方案,实现更高的敲低效果
  • 在实验早期确定细胞活力,节省不必要的时间

订购阴性RNAi对照
订购阳性RNAi对照

RNAi对照

对照类型 建议用途
转染对照 通过荧光计算和监测转染效率
阴性对照 用于测定相对本底敲低水平的非特异性RNAi对照;也可能是您的siRNA的序列打乱版本
阳性对照 RNAi已知可实现较高的敲低水平;如果对其进行标记,可用于测定递送情况并优化实验条件
恢复实验 有助于确保表型是因为敲低感兴趣的基因而获得
附加RNAi对照指南 有关同一靶标的多个siRNA序列,RNAi滴度测定、未转染对照和下游对照的指南,请见后文。

转染对照

在过表达实验下,即便是在低转染效率下往往仍能获得高得率结果。而如果要测定细胞群里的基因敲低效果,务必要实现尽可能高的转染效率。即便转染效率稍有下降,也可能导致您鉴别实验样本功能差异、通过qRT-PCR或免疫印迹分析验证敲低效果的能力受到限制。

为了实现尽可能高的转染效率——尤其是在基因敲低实验中——首先应优化您的细胞系的转染条件。此外,还必须要监测实验间的转染波动情况。

根据细胞类型和其他因素,共有几种转染试剂可选。您可以使用这些试剂和荧光标记的siRNA双链,监测转染效率。


阴性对照

阴性对照siRNA(不靶向任何基因产物的siRNA序列)是测定siRNA递送效果和为siRNA处理过的样本提供比较基准的必要前提条件。阴性对照有Silencer® Select siRNA、Stealth RNAi™ siRNA和Silencer® siRNA三类可供选择。 详细了解各种类型siRNA之间的差异.

我们建议每一次RNAi使用一种或多种阴性对照,您还应使对照siRNA与实验siRNA类型相匹配(例如,对于使用Silencer® Select siRNA的实验,仅可使用 Silencer® Select siRNA对照)。

订购阴性RNAi对照

Silencer® Select阴性对照

两种Silencer® Select阴性对照siRNA包含同一种旨在降低脱靶效应(在其他Silencer® Select siRNA之中较为常见)的修饰,且无与小鼠、大鼠或人基因序列明显相似的序列。这一类阴性对照siRNA已经通过微阵列分析进行测试,结果表明其对基因表达的影响微乎其微。此外,这一类对照还采用多参数细胞检测实验进行过测试,结果证明其对待测细胞系的细胞增殖、活力或细胞形态无明显影响。

Stealth RNAi™ siRNA 阴性对照

对于使用Stealth RNAi™ siRNA的实验,我们已经预先设计出了具有以下特征的阴性对照:

  • 三种水平的GC含量,以匹配三种实验用Stealth RNAi™ siRNA的GC含量:高、中等和低
  • 与任何已知脊椎动物基因无同源性
  • 针对多条双链进行过序列测试,未诱导产生应激反应

此外,您还可使用BLOCK-iT™ RNAi Designer选择任何Stealth RNAi™ siRNA序列的scrambled(序列打乱的)对照。我们的RNAi载体克隆试剂盒之中还随附一种阴性对照。这种阴性对照和靶标RNAi分子具有相同的化学结构。例如,如果您目前正在使用shRNA载体,则阴性对照应具有与之相同的载体骨架,但RNAi序列不同。 详细了解如何使用Stealth RNAi™ siRNA对照.

Silencer® siRNA阴性对照

Ambion® Silencer®阴性对照siRNA无与小鼠、大鼠或人基因序列明显相似的序列。这一类对照经过细胞筛选法进行过测试,结果证明其对细胞增殖、活力或细胞形态无明显影响。

  • 无靶向性,与已知基因相似的序列有限
  • 经过了人、小鼠和大鼠细胞使用验证
  • 经功能实验证明,对细胞增殖和细胞活力的影响微乎其微
  • HPLC纯化,双链,可直接使用

阳性对照

阳性对照可帮助您确认实验条件可达到获取可靠数据的要求,让您对自己的RNAi对照试验结果更为自信。阳性对照为已知可以达到高敲低水平的siRNA分子(>70%)。阳性对照应用于优化siRNA递送条件,并重新验证各个RNAi实验的高递送水平。如果阳性对照未能产生预期的表型,则请仔细地评估您的实验条件,以便判定是否需要调整某些因素。典型的阳性对照实例为可轻松检测到表达水平的基因,例如 p53、lamin和GAPDH。阳性对照分Silencer® Select siRNA、Stealth RNAi™ siRNA和Silencer® siRNA三类可选择。详细了解不同类型的siRNA之间的差异.

您还应确保对照siRNA与实验用siRNA类型相对应(例如,在使用Silencer® Select siRNA的试验中,仅可使用Silencer® Select siRNA对照)。

订购阳性RNAi对照

Silencer® Select siRNA阳性对照

Ambion® Silencer® Select阳性对照siRNA已经过反复验证,是很多siRNA试验理想的对照用品。

  • 高级siRNA、高度纯化,可直接使用
  • 已采用多种常用细胞系进行过功能测试
  • 内含Silencer® Select siRNA修饰,具有更强的特异性
  • 可用于人、小鼠和大鼠细胞
Stealth RNAi™ siRNA阳性对照

Stealth RNAi™ siRNA阳性管家基因对照双链是RNAi试验是应用在RNAi试验中。作为对照物的理想选择,用于评估敲低效率、优化RNAi试验。这一类对照具有以下特征:

  • 专用于有效敲低预定靶标
  • 已经过反复测试,以即用形式供货
Silencer® siRNA阳性对照

Ambion® Silencer®阳性对照siRNA最适于用于开发和优化siRNA试验。

  • 经验证可用于优化siRNA试验的siRNA对照
  • 基因特异性siRNA,随附序列打乱的阴性对照
  • 已采用多种常用细胞系进行过功能测试
  • HPLC纯化,双链,可直接使用

恢复试验

之所以进行RNAi恢复试验,是为了确认观测到的效果是由于靶标基因敲低造成的。如果您使用诱导型RNAi载体系统,则从培养基中去除四环素,关闭RNAi的表达。如果您使用Silencer® Select siRNA或Stealth RNAi™ siRNA,则主要有两种方法来恢复表型。第一种方法包括设计靶向3’ UTR的RNAi序列,并在敲低之后采用表达感兴趣的基因的开放阅读框(ORF)的载体转染细胞;第二种方法的前提是RNAi序列设计用于ORF,您可以使用GeneArt®基因合成试剂盒或一种诱变试剂盒,在RNAi序列靶向区域(最好是反义链的种子(seed)或切割区域(2-12碱基))内创造一个或多个沉默第三密码子点突变。


附加RNAi对照指南

多个靶向同一靶标的siRNA序列

与其他靶标局部同源的siRNA序列可能会引起脱靶活性。基因表达谱试验已经证实,与其他转录本局部同源的双链复合物可以切割靶标,或者发挥类似于microRNA (miRNA)的作用,抑制靶标mRNA的翻译。某些研究证实,siRNA双链复合物可能会因靶标RNA的数量、位点、与靶标RNA错配的碱基对组成等而具有不同的活性。为了确保目标基因敲低能够引起特定的siRNA表型,应至少采用两种靶向靶标mRNA的非重叠区域的siRNA分子验证表型结果。因此,如果一种siRNA序列产生了特定的表型,而第二种siRNA序列(设计用于靶向同一靶标)产生了其他表型,则无法推断关注的基因被成功敲低。

siRNA滴度测定

Silencer® Select siRNA和Stealth RNAi™ siRNA即便在低浓度下仍然非常有效,您应尽量使用最低效率水平,以免改变细胞的正常过程。滴定一定剂量的Silencer® Select siRNA 和Stealth RNAi™ siRNA双链复合物,可以让您降低脱靶或非特异性效应,同时维持稳定的敲低效果。

下游对照

在转染细胞,执行qRT-PCR和免疫印迹分析以测定mRNA和蛋白表达水平之前,我们建议您验证自己的下游试剂。在使用您的细胞系进行敲低实验之前验证阳性对照和靶标基因的qRT-PCR引物和抗体,有助于确保您的试剂具有足够的灵敏度,可以检测到由于基因敲低引起的靶标基因表达变化。如果缺乏足够的灵敏度,则难以解读低表达水平基因或蛋白产生的敲低结果。