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消除、检测与抑制RNase

RNase在核酸代谢中发挥着重要作用,几乎任何一种原核生物与真核生物细胞类型中均可找到RNase。人类机体在眼泪、唾液、粘液和汗液等体液中分泌这些RNase,通过它们来防御微生物的入侵。RNase也存在于皮肤碎屑中,掉落于实验台的毛发上,或粘附于衣物的宠物毛发内。不过,大多数环境中RNase的首要来源是微生物——即细菌和真菌。本文我们将探讨在RNA的操作过程中,如何消除、检测和抑制RNase。

RNA基础知识

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避免RNase污染的来源

体液(指酶:Fingerase)

体液(如汗液和皮肤油)中含有丰富的RNase活性(此类来源的RNase也被戏称为指酶Fingerase,即手指上的酶)。因此,双手不戴手套会非常容易造成RNase污染,从而对关键实验造成影响。请在实验过程中佩戴手套,并经常丢弃用过的手套,再换上一副新的手套。

  • (提示:与裸露皮肤接触过的,摸过冰箱把手、门把手、移液器、钢笔/铅笔或实验室电话的手套均可视为被RNase污染)

一直穿着实验服,以避免您衣物上的某些颗粒物质掉入样品。请避免在气流扰动的环境或可能形成微粒的表面附近(如黑板)操作RNA。

枪头与离心管

高质量的实验室塑料耗材一般可视为不含RNase。不过,枪头和离心管容易成为被忽视的RNase污染源。请确保从未开包的枪头盒中取用枪头,离心管也需来自未开包的,或经小心操作的包裹。仅进行高压灭菌操作无法破坏全部RNase活性,因为这些酶类耐受性强,而且降至室温后又会重新恢复部分活性。请务必使用经过无RNase检测并具有相关认证的枪头和离心管。Life Technologies提供品种、规格齐全的经认证过的无RNase(RNase-free)的枪头和离心管以满足广泛的实验需求。在操作RNA的过程中,请使用带RNase-free隔离层(滤芯)的加样枪头以避免引入RNase或RNA样本之间的交叉污染。多种尺寸的Ambion RNase-free枪头(包含滤芯的枪头)能够适配绝大多数的常规移液器。我们同时也提供常规型和无粘附性的微型离心管,可适用于任何分子生物学实验。每一批次的枪头和离心管都经RNase与DNase污染的严格检测,并通过无核酸酶(nuclease-free)的相关认证。

需要使用玻璃器皿和金属器皿时,请使用RNaseZap试剂或湿巾进行处理。如需使用大量器皿,也可对其进行烘烤处理。烘烤操作通常需要在450°F(232°C)下进行2小时或更长时间(不要放入胶带,会导致起火!)。在烘烤之前,请确保将金属器皿物体,以及烧杯和烧瓶的顶部用铝箔包好,以避免在烘烤之后再度发生污染。如果两小时的等待时间过长,请使用RNaseZap试剂或湿巾作为良好的替代法进行处理。请务必确保RNaseZap 试剂不要与钳、铲或其他具有活性金属表面的器皿(如铝制物品)接触超过数分钟,因为这会导致金属表面的腐蚀。将烘烤好的或RNaseZap试剂处理过的物品标上RNase-free的记号,以便与未处理的物品进行区分。我们推荐将处理过的物品存放于明确标有RNase-free的区域内,以避免偶然性的污染事件。

水与缓冲液

由于RNase无处不在,供水设备的来源及日常维护常导致分子生物学应用中的水和缓冲液成为RNase污染的常见来源。焦碳酸二乙酯(DEPC)处理是灭活水和缓冲液中RNase最常用的方法。不过,包括Tris在内的某些试剂不能使用DEPC进行处理。我们能提供多种Ambion缓冲液和水(经DEPC处理或未经DEPC处理)的相关产品,经过严格的质量控制以确保其中去除了RNase。除了DEPC处理之外,我们还提供RNAsecure™,可用于处理Tris这类含伯胺的溶液,且无需2小时的处理时间或高压处理。

DEPC处理是消除水体、缓冲液及其他溶液中RNase污染最为常用的方法。(注意:某些缓冲液不能使用DEPC。请参见下方的段落,以及“DEPC的替代品”部分。)DEPC能够通过修饰RNase及其他蛋白中的-NH、-SH和-OH基团来破坏酶的活性。处理步骤通常包括将溶液与0.1%的DEPC在室温下共同孵育数小时——通常过夜——之后对溶液进行高压处理以去除残余的DEPC。部分研究人员注意到在对DEPC处理的溶液进行高压灭菌之后,会嗅到一种果味的芳香气味,便担心这可能是未灭活的DEPC。其实这是由于高压灭菌灭活DEPC过程中,产生了少量的乙醇。乙醇可能会与痕量的羧酸相结合,生成挥发性酯类从而散发出此种特殊气味。这并不是DEPC未经完全消除的信号,不会对后续反应造成干扰。

含有伯胺基(如Tris)及一些含有仲胺或叔胺(如HEPES)的试剂不能使用DEPC进行处理。胺基会与DEPC反应并将其吸收,这样就无法实现对RNase的灭活处理了(参见178号技术通告)。同时,对试剂中胺基的修饰也会影响其缓冲能力。对于只能进行过滤除菌,而不能耐受高压灭菌的溶液,如MOPS,也就不适合用DEPC来处理,因为高压灭菌是灭活DEPC必不可少的步骤。

RNAsecureTM试剂可作为一种方便易用、无致癌性的DEPC替代品,用于处理少量珍贵试剂或Tris、MOPS等无法使用DEPC进行处理的溶液。本品以25倍储存液的形式提供。RNAsecureTM试剂储存液被溶液稀释之后,将其置于60°C十分钟,以激活本品。不同于DEPC(DEPC处理法无法消除处理后引入的RNase污染),经RNAsecureTM试剂处理过的溶液仍可重新加热,以帮助消除新的RNase污染。如需重悬RNA沉淀,我们也提供了1X工作浓度的RNAsecureTM重悬溶液(RNAsecure™ Resuspension Solution)

商品化和实验室制备的酶类都可能成为RNase的潜在污染源。在Life Technologies,我们使用RNaseAlert试剂来确定大量市售酶类中RNase污染的程度。您在操作RNA的过程中必需选用RNase-free的酶类,这点至关重要。我们针对各类RNA分析实验提供了相应的RNase-free酶。

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检测RNase污染

当RNase污染导致实验失败时,确定何种溶液或仪器部件发生问题通常既困难又耗时。

缓冲体系、溶液与表面

查找和确定RNase污染源常常是一项旷日持久却无果而终的工作。最为简单但又最昂贵的解决方案是丢弃现有试剂的全部储存液——特别当某一试剂被怀疑为污染源时——并启用全新批次的RNase-free试剂。另一个可选项是针对疑似污染溶液测试其中的RNase。用户可使用RNaseAlert实验室检测试剂盒(RNaseAlert Lab Test Kit)进行测试。本试剂盒为非同位素标记产品,允许研究者快速鉴定污染的试剂和设备。RNaseAlert实验室检测试剂盒的操作流程中使用了一种经过优化的RNA寡聚核苷酸,该物质经过荧光和淬灭基团的双重标记,进而(在相关测试中)作为RNase污染物的靶标。当RNase存在时,该底物即被降解,释放出的荧光素随即发出荧光。荧光信号可通过肉眼或荧光计进行检测。相同技术也可方便地用于枪头、离心管、玻璃器皿及其他任何表面上RNase污染的检测。

RNA样品

RNase进入RNA样本可在多种情况下发生,如RNA分离时(少量RNase在RNA制备过程中引入),或日常取用时(会不可避免地需要重复开关样品管并插入可能被污染的加样枪头)。RNase的污染通常可以从样品RNA的降解看出端倪。

可于变性琼脂糖凝胶中对总RNA样本(2-5 µg)电泳分析,并使用溴化乙锭染色分析,或通过Agilent 2100 Bioanalyzer™ 设备进行分析(图1)。完整的总RNA样本中28S与18S核糖体RNA条带会显示出2:1的信号强度比率。核糖体比值显著低于2:1通常意味着发生了降解。

 

 

 

图1a.完整RNA与降解RNA之间的对比。分别取2微克的降解总RNA及完整总RNA与Ambion的RNA Millennium Markers™一同进行1.5%的变性琼脂糖凝胶电泳。在完整RNA样品中可以清楚地观察到18S和28S核糖体RNA。而降解RNA则表现为较低分子量的弥散条带。

 

图1b.Agilent 2100 bioanalyzer数据。该图为高质量的真核总RNA样品的电泳图。在39秒及46秒位置分别可以观察到清晰的18S和28S峰。2100 Bioanalyzer™设备的微泳道充满了一种筛分聚合物和荧光染料。样品可以通过其发出的荧光而被检测到,其信号可转换为电泳峰图或类凝胶电泳图像(数据未显示)。
 

可用GAPDH、cyclophilin、或beta-actin等看家基因的探针,通过northern分析来评估poly(A) RNA样品的完整性。由于在变性胶中RNA样品会依据大小得到分离,降解产物会在全长mRNA的条带下显现为弥散的条带。降解的严重程度可通过低分子量弥散条带的增加加以判断。全长mRNA的预期位置处缺失目的条带/弥散信号,或在凝胶底部出现条带/弥散信号意味着RNA已经发生了严重降解。

降解的RNA样品不适于进行Northern分析、RACE方案,或全长cDNA文库的构建。不过,除非样本发生严重降解,反转录实时定量PCR(RT-qPCR)的应用中对于小扩增子的分析一般不会受到影响。带有某种程度降解的RNA样品仍可进行一些其它类型的分析,如二代测序,以及核酸酶保护分析(NPAs)。在某些类型的样品(如福尔马林固定,石蜡包埋(FFPE)样本或储存时间过久的样本)中,RNA降解是不可避免的。

操作RNA时的注意事项

操作RNA时一些基本的注意事项。这些常识性的预防措施会对减少RNase污染大有帮助。

  • 在实验过程中戴着手套可避免源自人手的RNase污染
  • 触摸皮肤(例如您的面部)、门把手及普通物体表面后更换手套
  • 使用RNA操作专用的移液枪组
  • 使用经检测,确保为RNase-free的枪头和离心管
  • 使用RNase-free的化合物与试剂
  • 将实验室内一片远离/遮蔽通风孔或开放窗口,走动较少的区域指定为RNase-free区域。

 

在酶促反应中抑制RNase

在体外转录、反转录和翻译等酶促反应中对抗RNase的传统方法是使用人类胎盘核糖核酸酶抑制剂(也称为RNase抑制剂蛋白,RI或hPRI)。这一蛋白仅针对核酸酶当中的RNAase A家族具有抑制性,该家族的成员包括RNase A、B和C。该抑制的模式为非竞争性的,即该蛋白并不会破坏这些RNase,而只是与其按1:1的比例结合。因此使用该抑制剂一个潜在的问题是其自身也可能被RNase污染。长时间与存在污染的抑制剂共同孵育,有可能会向酶促反应系统中缓慢释放核酸酶。因此,尽管这种抑制剂有助于解决多种核酸酶污染的情况,它并不一定是现有的最佳抑制剂。

SUPERase•In™ RNase抑制剂是RNase的广谱抑制剂,能够保护RNA免受RNase A家族成员的降解,并且对RNase T1与RNase I也有抑制作用。我们推荐用户在所有酶促反应中使用本品,它是胎盘核酸酶抑制剂(RI或hPRI)的一个更优的替代品。

我们也为体外转录、RT-qPCR和翻译等反应提供了非酶的替代品——RNAsecure™试剂

关于RNase酶

RNase——特别是RNase A家族的成员——是一些微小紧凑的蛋白,它们含有一些半胱氨酸残基能够形成许多分子内二硫键。因此在冷却至室温后,在无变性剂存在的条件下,变性的RNase会重新恢复其天然结构及部分功能。因此,RNase在反复冻融,甚至高压灭菌后仍会保留相当的活性。这些酶类稳定的天然属性使它们对众多的去污染方法具有抵抗性,通常需要强力的化学方法来消除物体表面和溶液中的RNase。

RNAsecure™试剂

RNAsecure™ 试剂可作为一种方便易用、无致癌性的DEPC替代品,用于处理少量珍贵试剂或Tris、MOPS等无法使用DEPC进行处理的溶液。本品以储存液(25倍)的形式提供。RNAsecureTM试剂储存液被溶液稀释之后,将其置于60°C十分钟,以激活本品。不同于DEPC(DEPC处理法无法消除处理后引入的RNase污染),经RNAsecureTM试剂处理过的溶液仍可重新加热,以帮助消除新的(RNase)污染。如需重悬RNA沉淀,我们也提供了1X工作浓度的RNAsecureTM重悬溶液(RNAsecure™ Resuspension Solution)

实验室表面

实验室表面,如实验台、离心机和电泳设备,都应该被认为存在RNase污染,因为这些表面通常都暴露于环境当中。这些表面会由于实验室环境中广泛存在的细菌和真菌孢子而受到污染。类似的情况还包括从人体皮肤脱落的死细胞,也会造成暴露表面的污染。用户应该假定常规的实验室环境均遭受了潜在的污染。可使用RNaseZap等RNase去污染溶液处理这些表面,这些试剂为三种不同成分组成,专为完全灭活RNase(及其他任何酶类)而设计,一旦接触即发挥作用。使用时直接将本溶液喷洒在需要去污染的表面,随后使用去核酸酶的水进行清洗。RNaseZap 湿巾,是预先浸泡了RNaseZap试剂的小纸巾,可十分方便地处理枪头、实验台台面及其它表面。常规的去垢剂溶液无去污染效果,甚至会造成更大的问题,因为去垢剂可能将RNase污染扩大到整个区域。

内源性RNases

所有的组织样品都含有内源性的RNases。组织取样后若不进行直接处理(如RNA抽提等),常常需要用液氮迅速冷冻,这样可使RNA的降解达到最少。不过,在液氮中冷冻组织再进行后续操作通常并不方便,特别是对于大量需要保存的样本而言。RNAlater溶液是用于保存和稳定化组织的溶液,可保护组织和细胞中的RNA。使用者可在RNA分离操作之前,将组织块简单地浸入5-10倍体积的RNAlater溶液中,经此处理的样本即可于4°C保存长达一个月。

RNA样品

与RNA分离产物共纯化出的少量RNase可能对后续应用造成干扰。相关操作所使用的枪头、离心管及其他试剂也可能引入此类污染。RNase抑制剂在针对RNA的大多数酶学操作中作为一种常规的预防措施,以确保将污染排除在外。只有SUPERase•In™ RNase抑制剂能够同时抑制RNases A、T1和RNase 1(胎盘核酸抑制剂(RI)仅能抑制RNase A)。

质粒制备

为体外转录和转录-翻译偶联反应而制备的质粒DNA有可能将RNase污染引入反应体系。许多研究人员会使用RNase处理步骤去除质粒制备产物中的RNA。如果采用了RNase处理这一操作,我们则推荐对样本进行蛋白酶K处理+酚氯仿提纯的步骤,以期在开展后续反应之前,消除所有可能存在的RNase。如果DNA模板已经过限制性酶切而被线性化,我们也推荐使用类似的步骤,因为限制性内切酶中也可能存在RNase的污染。

:强烈建议使用核糖核酸酶进行处理的步骤在专用空间内进行,以避免RNA样品不慎接触到RNase

RNA储存

痕量的RNase即会降低RNA的完整度,即使对冰冻储存的液相样本也是如此。短期保存时,可将RNA样本重悬于RNase-Free水(加入0.1 mM EDTA)或TE缓冲液(10 mM Tris,1 mM EDTA)并存储于–80°C。使用含有螯合剂的缓冲液是保存RNA的更优选择。针对Mg2+和Ca2+等二价阳离子的螯合作用能够避免加热所导致的链断裂效应(Mg2+存在的条件下进行加热可造成RNA的化学裂解)。我们为RNA的保存提供了不含核酸酶的水以及多种Ambion缓冲液,包括TE,0.1 mM EDTA和RNA存储液具有低pH值的额外优势)。全部这些产品都经过严格的质量控制步骤,均去除了核酸酶。

长期保存RNA的最佳方法是对预先分装的样本进行盐/酒精沉淀操作,并将此沉淀溶液保存于–20°C。低温和酒精能够有效抑制所有酶类的活性。比中性pH更低的酸碱度(添加醋酸钠或醋酸铵)也有助于稳定RNA。请注意,在进行任意后续应用前需先离心沉淀RNA并去除该储存液。另一个选择是将RNA重悬于RNAsecureTM重悬溶液中,该产品中包含了RNase的灭活试剂。加入RNAsecure™溶液之后,将样品简单加热至60°C,保持10分钟,以灭活RNase。如果在后续操作中怀疑发生了样品污染,用户仍可再次加热以灭活这些新发生的污染。

化学核酸酶

当观察到RNA的降解情况时,尽管RNase的污染是最为常见的推测,不过RNA分子在二价阳离子存在的加热条件下其实也会发生链的断裂,如在含有Mg2+或Ca2+离子的条件下,在>80°C的温度下作用5分钟或更长时间。因此,如需加热RNA样本,则最好在螯合剂存在的条件下进行。RNA存储液专为RNA的存储用途而设计。它包含1 mM的柠檬酸钠,可有效螯合二价阳离子,并具有相对较低的pH值(6.4左右),能够使RNA碱基的水解情况最小化。

仅限研究用途,不可用于任何人或动物的治疗或诊断。

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