RNase操作注意事项

大多数研究人员都非常关注RNase污染风险,但我们不想过度讨论这个问题或引起一些不必要的担忧。根据已有经验,我们发现,如果用于RNA应用的微量离心管来自从未打开过的袋中或已经采取措施避免污染的袋中,就没有必要再去对其进行相关处理。然而,我们确实一直发现,一些微量离心管(包括注明不含RNase的微量离心管)投入使用后会导致RNA降解。我们建议在操作任何试剂或反应容器时,都必须佩戴手套(注意:触摸过冰箱把手、门把手或移液器的手套可能含有RNase)。而在进行会使用RNase的操作(如核酶保护实验或质粒纯化等)时,都必须特别注意防止移液器无意中受到RNase污染。另外一个潜在污染源是移液器侧面的金属推进装置。当需要将移液器推进大容器中时,应将金属推进装置卸下,以免其可能接触容器壁或容器内的物品。

A.检测RNase
RNase污染可以导致实验失败,但要找出哪份溶液或哪个实验仪器是污染源非常困难且耗时。Ambion的 RNaseAlert™ Kit (产品货号1964)可以让研究人员无需同位素标记即可轻松鉴定出污染试剂或仪器。RNaseAlert Kit使用一种用荧光基团和淬灭基团双标的优化RNA寡核苷酸作为任何污染RNase的靶标。当RNase存在时,底物会被切割并释放出荧光基团发出荧光。该荧光信号可通过肉眼或荧光检测仪检测到。

B. 去除RNase
如果试剂或仪器的RNase污染会影响后续实验,则需采取额外的预防措施。对吸头、试管和溶液进行高压灭菌都不足以使RNase失活。可以在300°C高温下烘烤玻璃器皿4小时,以及对塑料器皿、管和大多数溶液进行DEPC处理(参见下文),但这些操作都非常耗时,而且DEPC价格昂贵且有可能致癌。Ambion的 RNaseZap™ (产品货号9780)可以用来去除玻璃器皿、塑料器皿、工作台面和移液器上的RNase。该溶液可以有效灭活eppendorf管底部干燥的5 µg RNase,且不会抑制在同一管中进行的后续酶促反应。RNaseZap™包含三种已知可以抗RNase的成分,可以直接倒在表面或涂抹于表面,并且接触后可立即生效。处理完成后,相关的器具只需使用蒸馏水简单冲洗两次即可使用。

对溶液进行DEPC处理以去除RNase

为了保证溶液中没有RNase污染,可以使用焦碳酸二乙酯 (DEPC) 来处理溶液(警告:DEPC是一种潜在致癌物,操作时应采取必要的防护措施,如总是佩戴手套、在允许该操作的通风橱中操作等)。DEPC可以和蛋白质的组氨酸残基反应从而灭活RNase。但DEPC也可以与RNA反应,因此在使用溶液前需要通过加热去除DEPC(DEPC加热后降解为CO2和乙醇)。向溶液中加入DEPC使其浓度达到0.05 - 0.1%(即每升溶液加入0.5-1ml DEPC),然后搅拌或振荡溶液,孵育数小时后,高压灭菌至少45分钟或直至无DEPC气味。需注意,含有伯氨基团的化合物如Tris(2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇)等,也可以与DEPC反应,因此该类物质应该在DEPC处理完毕后加入。注意:我们观察到,蒸馏水在经过DEPC处理及彻底高压灭菌后,对网织红细胞裂解物的翻译有20%的抑制。我们发现蒸馏水一般是没有RNase的,因此不需要处理。

如何储存RNA

RNA的储存方法有许多种。短期储存可以用无RNase的水(含0.1 mM EDTA) 或 TE缓冲液 (10 mM Tris,1mM EDTA)。RNA通常可以在-80° C下保持稳定长达一年而不降解。镁离子和其他金属离子会催化对RNA的非特异性剪切,若要储存RNA并使其保持完整,可以加入EDTA来螯合这些金属离子。需要特别注意的是,应确保使用的EDTA溶液不含RNase(久置的EDTA溶液可能生长有微生物,因而可能会使RNA样品受到核酸酶污染)。还可建议将RNA溶解在甲酰胺中,并储存在-20°C条件下,这样可以至少保存一年不降解(Chomczynski,1992)。

若是长期储存,可以将RNA以乙醇沉淀物的形式储存在-20°C下。使用常规方法评估这些样品非常麻烦,但如果精确定量很重要,就必须将这些沉淀物溶解在水溶液中然后再吸出。另外一种方法是直接将已经涡旋过的均一混悬液的乙醇沉淀物吸出,但我们发现该方法仅适合定性研究,对于定量实验而言则太不准确。RNA在乙醇中不会均一分布,可能是因为形成了聚合物,然而这种不均一性会导致同样的取样体积中RNA量的不相同。

如何沉淀RNA

A.用醇类沉淀
用醇类(乙醇或异丙醇)沉淀RNA需要最低浓度的单价离子(如: 0.2 M Na+, K+; 0.5 M NH4+) (Wallace,1987)。在调节盐浓度后,加入2.5倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀RNA,完全混合后在-20° C冷却至少15分钟。尽管异丙醇在沉淀RNA方面不够高效,但在 NH4+ 存在的情况下,异丙醇比乙醇能更好地保存溶液中游离的核酸,从而使其与沉淀的RNA分离。RNA浓度越高,RNA沉淀就越快越彻底。一般规律是10 µg/ml的RNA可以毫无困难地在数小时或过夜情况下沉淀,而更低浓度的RNA应该加入载体核酸或糖原帮助其沉淀,并使其能够最大程度地复溶。

B. 用氯化锂沉淀
氯化锂 也可以用来沉淀RNA,并且还有不会沉淀糖、蛋白质和DNA的优势。氯化锂通常用来去除与通过其他方法制备RNA时引入的翻译抑制物。需使用2-3 M浓度的LiCl来沉淀RNA(加入等体积的4 M LiCl、20 mM Tris-HCl,pH 7.4和10 mM EDTA即可)。注意,使用LiCl沉淀不需要加入乙醇。RNA应该在-20°C下沉淀,沉淀时间取决于RNA浓度。通常让RNA沉淀数小时或过夜都是安全的。在离心收集RNA后,用70%的乙醇清洗沉淀物,以去除痕量的LiCl。LiCl可以高效地沉淀300nt长度以上的RNA。虽然LiCl能够有效沉淀更稀的溶液中的RNA,但为了获得最好的结果,RNA的浓度应该超过200µg/ml。

结合和产量

结合百分比通过比较结合至合成RNA中的放射性物质的量与反应体系中总放射性物质的量计算得到。通常通过TCA沉淀法(见下文)进行,但也可通过简单的计数在去除未结合放射性物质的核苷酸前后等体积溶液中的转录反应得出。注意,用来比较的计数必须先按等体积组分进行调整。未结合的核苷酸可以用LiCl、NH4OAc或EtOH(见上文)沉淀,转录反应溶液通过不含RNase的Sephadex柱(如Ambion的 NucAway™柱), 或通过胶回收来去除沉淀。

结合至RNA的放射性物质的量也可通过三氯乙酸(TCA)沉淀和过滤后,利用液体闪烁计数器确定。将2 µl的RNA标记反应液加入至98 µl包含10 µg载体DNA或RNA的水中,然后加入2 ml的95%冷TCA,振荡后在冰上孵育5分钟。在真空条件下通过GF/C玻璃纤维滤膜收集沉淀物。用2 ml 10% TCA洗涤样品2次,然后用95%乙醇洗涤样品1次,使洗液通过滤膜。干燥后,将这些滤膜放置在带有液体闪烁计数器的管中进行计数。注意:RNA和DNA都可使用这种方法沉淀。

由于放射性标记核苷酸的结合百分比直接与产量成正比,因此转录反应的实际产量与理论最大产量就成比例相等。举例来说,当转录反应包含3 µM的核苷酸时,Ambion的MAXIscript™ Kit 反应的理论100%产量即为77ng。因此,如果给定反应的结合百分比为80%,则可以合成0.80 X 77 ng,即62 ng的标记RNA。

不同真核生物的核糖体亚单位大小关系见表1。18S和28S rRNA均包含修饰的核苷酸,包括甲基化核糖和假尿苷(其中18S的数量分别为46和37;28S的数量分别为71和60)。

  平均碱基数
物种 18S 28S
果蝇 1976 3898
大鼠 1874 3898
1868 5025

表1、典型真核生物中的核糖体亚单位大小。

RNA分子量标准

Ambion提供多种不同类型的RNA分子量标准,包括用于EtBr染色的非标记型标准品和可直接用于下游检测的生物素标记型标准品。其中, RNA Century Marker Set (产品号#7140 - 未标记;#7175 - 生物素标记)包含5个长度范围均匀分布在100 -500 nt的转录本,是核糖核酸酶保护实验及RNA探针凝胶纯化的理想选择。该产品也可以DNA(产品号7780和7782)为模板通过体外转录反应合成放射性标记的RNA来获得。Ambion的RNA Millennium Marker Set (产品号#7150 – 未标记;#7170 – 生物素标记)包含10个0.5-9.0kb范围内的转录本,可用于Northern分析。

RNA转录本和双链DNA标准(如pUC 19/Hpa II,产品号# 7760 和# 7770) 也可以用多聚核苷酸激酶(5'末端标记反应)或Klenow片段(3'反应)进行末端标记,变性后作为标记过的分子量标准使用。

其他用于指示RNA大小和迁移位置的标记物包括大多数上样缓冲液中都含有的二甲苯苯胺和溴酚蓝染料,以及用于Northern分析实验总RNA电泳过程中存在的rRNA。上样缓冲液中染料的迁移位置会受凝胶浓度和组成(变性凝胶或非变性凝胶)的影响。核糖体RNA构成了80%的总RNA样品。18S和28S在EtBr染色或UV条件下的Northern凝胶中都清晰可见。上表中给出了在不同真核生物中它们的大小。

参考文献

  • Chomczynski, P. (1992) Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nuc. Acids Res. 20:3791-3792.
  • Wallace, D.M. (1987) Precipitation of Nucleic Acids. Methods of Enzymology 152:41-46.